Medii nutritive diferențiate. Medii uscate. Profagul este

1.1. Endo media,Levina, Ploskireva. Folosit ca mediu electiv de diagnostic diferenţial pentru cultivarea bacteriilor intestinale (conţine lactoză). Microorganismele care fermentează zahărul din lapte (lactoza) găsite în aceste medii formează colonii colorate - lactoză pozitive (colonii roșii cu luciu metalic sau fără strălucire). Colonii de microbi care nu fermentează lactoza, incolore - lactoză-negative - roz pal, transparente, care transmit lumină.

La 100 ml de MPA (pH 7,6) la o temperatură de 70°C, se adaugă steril 5 ml de soluție de lactoză 20% și un amestec de 0,5 ml de soluție saturată de fuchsin bazic cu 1,25 ml de soluție de sulfat de sodiu proaspăt preparată. .

1.2. Medii cu amidon utilizat pentru identificarea microorganismelor care produc amilază. Prezența enzimei se determină prin adăugarea în cultură a câtorva picături de soluție Lugol

(culoarea mediului nu se schimbă). Amidonul nedigerat dă o culoare albastră cu această soluție.

1.3. Lapte. Odată cu creșterea microorganismelor care fermentează lactoza, aceasta se coagulează.

2. Truse comerciale - pentru studiul proprietăților biochimice(identificarea microorganismelor prin activitate zaharolitică și proteolitică).

2.1. Sâsâit mediu cu carbohidrați(glucoză, lactoză, zaharoză, arabinoză și altele ) în care se detectează activitatea enzimatică a microorganismelor.Sub influența acidului format în timpul descompunerii carbohidraților, indicatorul schimbă culoarea mediului. Un mediu galben pai își schimbă culoarea în roșu sau roz intens la o reacție pozitivă, motiv pentru care aceste medii sunt numite „seria pestriță”. Microbii care nu fermentează acest carbohidrat cresc pe mediu fără a-și schimba culoarea. Prezența gazului este determinată de formarea de bule în mediile cu agar sau de acumularea acestuia în „flotatorul” pe medii lichide.

Ingrediente: peptonă - 10 g, clorură de sodiu - 5 g, carbohidrați - 10 g, reactiv Andrede (fucsin) - 10 ml, apă distilată la 1000 ml, pH după sterilizare 7,2-7,4.

2.2. Medii pentru studiul proprietăților proteolitice

Medii cu gelatină. La unele bacterii (Vibrio holera, Staphylococcus, bacilul antrax etc.), enzimele proteolitice sunt detectate prin lichefierea gelatinei.

Miercurea cu lapte. Microorganisme care se descompun cazeină (proteine ​​din lapte), provoacă peptonizarea laptelui – capătă aspectul zerului.

Medii cu peptonă. Când peptonele sunt descompuse, pot fi eliberate indol, hidrogen sulfurat și amoniac. Formațiunile lor sunt determinate folosind hârtii indicatoare. Hârtia de filtru este preimpregnată cu anumite soluții, uscată, tăiată în fâșii și, după însămânțarea culturii pe MPB, se pune sub un dop între aceasta și peretele eprubetei. După incubarea într-un termostat, rezultatul este luat în considerare. Amoniacul face ca hârtia de turnesol să devină albastră; când hidrogenul sulfurat este eliberat pe o bucată de hârtie înmuiată într-o soluție care conține acetat de plumb și bicarbonat de sodiu, se formează sulfat de plumb - hârtia devine neagră; indolul provoacă înroșirea unei bucăți de hârtie înmuiată într-o soluție saturată fierbinte de acid oxalic.

2.3. Microteste - sisteme (MTS). Sunt plăci de polistiren cu godeuri care conțin medii sterile de diagnostic diferenţial.

2.4. Sisteme de indicare a hârtiei (SIB) - medii de diagnostic diferenţial pe hârtie de filtru.

Pentru cultivarea și diferențierea microorganismelor anaerobe: mediu Wilson-Blair. Preparat din agar peptonă-carne, la care se adaugă glucoză, Na2SO3 și clorură de fier FeCl2. Pe acest mediu, agentul cauzator al gangrenei gazoase formează înnegrirea și ruperea agarului. Creșterea are loc adânc în agar. În acest caz, Na 2 S0 3 este redus la Na 2 S (sulfit de sodiu), care se combină cu clorura ferică pentru a forma sulfat negru feros. Ruperea mediului nutritiv este asociată cu formarea de gaze.

la lucrarea nr 2

Microorganismele, ca toate ființele vii, au trei funcții fiziologice principale: nutriție, respirație și reproducere.

Concepte de bază ale subiectului:

Colonia - un grup de microbi vizibili cu ochiul liber pe un mediu nutritiv dens, crescând dintr-o singură celulă.

O colonie este descendentul microbilor crescuți dintr-o celulă. Deoarece toți microbii din colonie au crescut dintr-o celulă, aparțin aceleiași specii, adică fiecare colonie izolată (singără, necontopindu-se cu alte colonii) conține o cultură pură.

Cultură pură - o populație de microorganisme formată din indivizi dintr-o singură specie.

indicație - detectarea agentului patogen în materialul de testat (determinarea genului)

Identificare - determinarea tipului, tipului, biovarului, serovarului, fagovarului culturii pure izolate.

la lucrarea nr. 3

Respirația microorganismelor– oxidarea biologică a substratului cu eliberarea necesarului pentru metabolismul energetic.În funcție de tipul de respirație, microorganismele sunt împărțite în 3 grupuri principale: aerobi poate trăi numai în prezența oxigenului (Vibrio cholerae); anaerobi facultativi poate trăi cu sau fără orice procent de oxigen (E. coli); anaerobi (obligatoriu)– numai în absența oxigenului (agenți cauzatori ai gangrenei gazoase). La cultivarea anaerobilor obligatorii, trebuie create condiții speciale anaerobioza. În acest caz, se folosesc dispozitive și medii speciale (anaerostat, desicator, tioglicolat, mediu Wilson-Blair).

Mediile nutritive sunt clasificate în funcție de compoziția și scopul lor.

1.După compoziție mediile nutritive se împart în simplu si complex

Există un grup de medii de uz general - simple. Această grupă include bulion de peptonă de carne (bulion nutritiv simplu), agar peptonă de carne (agar nutrient simplu), gelatină nutritivă. Aceste medii sunt folosite pentru a crește mulți microbi patogeni. Mediile de uz general, sau mediile nutritive simple, sunt de obicei preparate din hidrolizate cu adaos de peptonă și clorură de sodiu. Ele sunt, de asemenea, folosite ca bază pentru prepararea mediilor complexe.

De asemenea, după compoziția lor, se disting medii minerale, fără proteine ​​și fără proteine. 2. După origine mediile sunt împărțite în artificial și natural (natural).

Mediile nutritive naturale pot conține componente de origine animală (de exemplu, sânge, ser, bilă) sau vegetală (de exemplu, bucăți de legume și fructe).

3.Conform scopului aloca medii de conservare(pentru însămânțare primară și transport), mediu de îmbogățire(pentru acumularea unui anumit grup de bacterii), medii de cultură(universal simplu, complex special și pentru formarea toxinelor), medii pentru izolare și acumulare (conservant, îmbogățire și selectiv) și mediu de identificare(diferențial și electiv-diferențial).

Medii de cultură conservante previne moartea agenților patogeni și suprimă creșterea saprofitelor. Cele mai utilizate sunt un amestec de glicerină, o soluție hipertonică, un conservant de glicerină cu LiCl 2, o soluție de citrat de sodiu și deoxicolat de sodiu.

Medii de îmbogățire pentru bacterii

Medii de îmbogățire(de exemplu, mediu Kitta-Tarozzi, bulion selenit, mediu tioglicolat) sunt folosite pentru a acumula un anumit grup de bacterii prin crearea unor condiții optime pentru unele specii și nefavorabile pentru altele. Cel mai adesea, diverși coloranți și substanțe chimice sunt utilizați ca astfel de agenți - săruri biliare, tetrationat de Na+, telurit K, antibiotice, fucsin, violet de gențiană, verde strălucitor etc.

Media se diferențiază și în funcție de scopul lor. diagnostic electiv, special și diferenţial.

Medii elective (selective, selective, acumulare, îmbogățire). Principiul creării mediilor nutritive selective se bazează pe satisfacerea nevoilor biochimice și energetice de bază ale tipului de microbi pentru care sunt destinate cultivării sau pe adăugarea de inhibitori care suprimă creșterea microflorei însoțitoare. O anumită compoziție și concentrație de nutrienți, microelemente, factori de creștere la o valoare a pH-ului strict definită sau adăugarea de inhibitori asigură condiții optime pentru cultivarea unuia sau mai multor tipuri de microorganisme. La însămânțarea materialului care conține un amestec de diferiți microbi pe ele, va apărea mai întâi creșterea speciilor pentru care mediul va fi selectiv. Exemple de medii elective sunt bulionul de bilă, bulionul selenit, mediul Ploskirev - pentru microbii în creștere din familia intestinală, apa peptonă alcalină - pentru Vibrio cholerae.

Bulion de bilă. La MPB se adaugă 10-20% bilă de bou. Bila suprimă creșterea cocilor și a florei aeriene, dar este favorabilă proliferării salmonelei.

Bulion de selenită. Constă din bulion de fosfat cu adaos de sare de sodiu a selenitului, care este un inhibitor al creșterii florei cocice și a Escherichia coli, dar nu inhibă creșterea salmonelei.

Miercuri Ploskireva. Un mediu dens care conține inhibitori ai E. coli, coli, dar favorabil creșterii Shigella și Salmonella, a căror reproducere nu este inhibată de verde strălucitor și săruri biliare.

Apă peptonă. Conține 1% peptonă și 0,5% clorură de sodiu. Mediul este selectiv pentru Vibrio cholerae, deoarece se înmulțesc mai bine decât alte bacterii în „medii înfometate”, în special cu o reacție alcalină, deoarece ele însele secretă deșeuri acide.

Medii speciale. Necesar pentru cultivarea bacteriilor care nu cresc pe medii nutritive simple. Pentru unele organisme, este necesar să adăugați carbohidrați, sânge și alți nutrienți suplimentari în mediile nutritive simple. Exemple de medii nutritive simple sunt bulionul de zahăr și agarul de zahăr pentru streptococ (preparat din MPB și, respectiv, MPA, la care se adaugă 0,5-2% glucoză).

Pentru pneumococi și meningococi, mediul special este bulionul de zer și agarul de zer (pentru prepararea bulionului de zer se amestecă 1 parte MPB cu 2 părți ser proaspăt; pentru obținerea agarului din zer se adaugă la topit 10-25% ser steril de cal sau bovin. MPA).

Medii de diagnostic diferențial folosit pentru determinarea speciei microbului studiat, pe baza caracteristicilor metabolismului acestuia. În funcție de scopul lor, mediile de diagnostic diferențial sunt împărțite după cum urmează:

1. Medii pentru detectare capacitate proteolitică microbi care conțin lapte, gelatină, sânge etc.

2. Medii cu carbohidrati si alcooli polihidroxici pt

detectarea diverselor enzime zaharolitice.

Următorii indicatori se adaugă la compoziția mediilor de diagnostic diferențial menite să identifice proprietățile zaharolitice și enzimele redox: roșu neutru, fucsin acid, albastru de bromotimol, albastru apos cu acid rosolic (BP). Schimbându-și culoarea la diferite valori ale pH-ului, indicatorul indică prezența unei enzime și descompunerea ingredientului introdus în mediu.

Exemple de medii de diagnostic diferenţial:

Endo mediu. Constă din MPA cu adaos de 1% lactoză și fucsin bazic (indicator) decolorat cu sulfit de sodiu. Mediul Endo are o culoare ușor roz. Folosit în diagnosticul infecțiilor intestinale pentru a diferenția bacteriile care descompun lactoza pentru a forma produse acide de bacteriile care nu au această capacitate. Coloniile de microbi lactoză-pozitivi (Escherichia coli) sunt roșii din cauza reducerii fuchsinului. Coloniile de microorganisme lactoză negative - salmonella, shigella etc. - sunt incolore.

Mediile de diagnostic diferențial includ scurte și extinse rând pestriț. Se compune din medii cu carbohidrați (Hiss media), MPB, lapte și gelatină peptonă din carne.

Şuierat media se prepară pe bază de apă peptonă, la care se adaugă mono-, di- sau polizaharide chimic pure (glucoză, lactoză, amidon etc.).

Pentru a detecta schimbările de pH ca urmare a formării acizilor și a descompunerii carbohidraților, se adaugă un indicator în mediu. Odată cu o descompunere mai profundă a carbohidraților, se formează produse gazoase (CO 2, CH 4 etc.), care sunt captate cu ajutorul flotoarelor - eprubete mici coborâte cu capul în jos în mediu. Mediile cu carbohidrați pot fi preparate și ca mediu dens cu adăugarea de 0,5-1% agar-agar. Apoi formarea de gaz este detectată prin formarea de bule (rupturi) în coloana mediului.

Pe MPB, care face parte din seria pestriță, se găsesc produse formate în timpul descompunerii aminoacizilor și peptonelor (indol, hidrogen sulfurat). Sulfat de hidrogen este detectată prin introducerea unei benzi de hârtie de filtru înmuiată într-o soluție de acetat de plumb în MPB după însămânțarea culturii. Când aminoacizii care conțin sulf se descompun, se eliberează hidrogen sulfurat, iar hârtia devine neagră din cauza formării sulfurei de plumb. Pentru determinare indol puteți folosi un indicator complex. Indolul se formează prin descompunerea triptofanului și poate fi detectat atunci când acest indicator este adăugat la o cultură crescută pe MPB. În prezența indolului, MPB devine verde sau albastru.

În laboratoarele bacteriologice practice sunt utilizate pe scară largă metode micro și expres pentru un studiu orientativ al proprietăților biochimice ale microorganismelor. Există multe sisteme de testare în acest scop. Cel mai des folosit sistem de hârtii indicatoare (SIB). SIB-urile sunt discuri de hârtie de filtru impregnate cu soluții de zaharuri sau alte substraturi în combinație cu indicatori. Astfel de discuri sunt coborâte într-o eprubetă cu o cultură crescută într-un mediu nutritiv lichid. Schimbarea culorii discului cu substratul este utilizată pentru a judeca funcționarea enzimei. Sistemele de microtestare pentru studierea identificării enterobacteriilor sunt reprezentate de recipiente din plastic de unică folosință cu medii care conțin diferite substraturi cu adaos de indicatori. Semănarea unei culturi pure de microorganisme în astfel de sisteme de testare vă permite să identificați rapid capacitatea bacteriilor de a utiliza citrați, glucoză, zaharoză, elibera amoniac, indol, descompune ureea, lizina, fenilalanina etc.

Agar nutritiv, precum și principalele medii de diagnostic diferențial, sunt produse în prezent sub formă de preparate uscate care conțin toate componentele necesare. La astfel de pulberi trebuie doar să adăugați apă și să le fierbeți, apoi, după turnare, să le sterilizați.

Sunt folosite pentru a distinge specii individuale sau grupuri de microorganisme. Principiul construirii acestor medii se bazează pe faptul că diferitele tipuri de microorganisme diferă unele de altele în activitatea biochimică datorită unui set diferit de enzime.

DDS include:

1. Baza nutritiva care asigura proliferarea microorganismelor

2. Anumite glucide - lactoza

3. Un indicator a cărui schimbare de culoare indică o deplasare a pH-ului mediului către partea acidă din cauza fermentației carbohidratului corespunzător.

DDS este utilizat în mod activ pentru a diferenția tipurile de microorganisme din familia intestinală.

Medii de cultură elective

Proiectat pentru izolarea selectivă și acumularea de microorganisme de un anumit tip (sau grup) din materiale care conțin o varietate de microfloră străină. Atunci când se creează aceste medii, ele se bazează pe caracteristicile biologice care disting microorganismele de majoritatea celorlalte. De exemplu, creșterea selectivă a stafilococilor este observată la o concentrație crescută de sare, iar Vibrio cholerae - într-un mediu alcalin.

Medii de scurgere

1. Mediu agar în cutii Petri:

a) se topește într-o baie de apă, se răcește la 45-50ºС cu MPA

b) asezati cana cu capacul sus

c) luați vasul în mâna dreaptă, ținându-l lângă foc

d) scoateți ștecherul cu mâna stângă, ținându-l cu degetul mic și palma

e) ardeți gâtul sticlei cu mediu și deschideți ușor capacul cu două degete ale mâinii stângi

f) se introduce gâtul sticlei sub ea, fără a atinge marginea cupei, și se toarnă 15-20 ml. mediu inconjurator.

Dacă semănatul se efectuează în ziua în care mediul este vărsat, atunci acesta trebuie uscat într-un termostat timp de 20-30 de minute în formă dezasamblată, cu partea deschisă în jos. Dacă semănatul se efectuează a doua zi, atunci cupele, fără uscare, se înfășoară în aceeași hârtie în care au fost sterilizate și se pun la frigider.

2. Mediu de agar în eprubete:

a) luați un vas cu un mediu topit și răcit la 45ºС

b) luați eprubeta cu mâna stângă

c) scoateți dopul din eprubetă cu mâna dreaptă, iar cu mâna stângă din vas cu mediu, ținându-l cu degetul mic și palma

d) ardeți marginile eprubetei și a vasului cu mediu, adăugați 3-5 ml de mediu în eprubetă

e) ardeți din nou gâturile recipientelor, închideți-le cu dopuri

Mediile de agar se pot solidifica în eprubete sub formă de:

1. Coloană teșită

2. Coloană combinată

3. Coloana

Pentru a obține o coloană teșită și combinată, eprubete cu masă de agar topită sunt așezate în poziție înclinată pe un suport special, astfel încât mediul să nu se extindă la 2/3 din eprubetă și să nu umezească dopul. După ce mediul s-a solidificat, eprubetele sunt plasate vertical într-un suport și condensul este lăsat să se scurgă. Este imposibil să folosiți mediul înconjurător fără condens. Ar trebui să fie topit din nou într-o baie de apă și cosit.

Agar peptonă din carne

Cercetarea asupra bacteriilor necesită o muncă meticuloasă cu numeroase echipamente și instrumente. Pentru ca microorganismele să se înmulțească cât mai repede posibil în condiții de laborator și să poată menține funcțiile normale de viață, se folosesc medii nutritive speciale. Compoziția și condițiile biofizice ale acestora sunt potrivite pentru creșterea activă a unei culturi bacteriene.

Medii nutritive. Microbiologie și alte aplicații

Coloniile de bacterii sunt crescute în condiții de laborator pe vase Petri, care sunt umplute cu conținut asemănător jeleului sau semi-lichid. Acestea sunt medii nutritive, a căror compoziție și proprietăți sunt cât mai apropiate de cele naturale pentru creșterea de înaltă calitate a culturii.

De exemplu, un astfel de mediu selectiv este potrivit doar pentru reproducerea Escherichia coli. Apoi, de la însămânțarea multor bacterii pe un vas Petri, vom vedea doar colonii din aceeași E. coli și nu mai mult. Înainte de a începe lucrul, este necesar să aveți o bună cunoaștere a metabolismului bacteriei studiate pentru a o selecta cu succes dintr-un amestec de alte specii.

Medii nutritive solide, semi-lichide și lichide

Bacteriile pot fi cultivate nu numai pe substraturi solide. Mediile nutritive diferă prin starea lor de agregare, care depinde de compoziția în timpul fabricării. Inițial, toate au o consistență lichidă, dar când se adaugă gelatină sau agar într-un anumit procent, amestecul se solidifică.

Mediile de cultură lichide se găsesc de obicei în eprubete. Dacă devine necesară creșterea bacteriilor în astfel de condiții, adăugați o soluție cu o probă de cultură și așteptați 2-3 zile. Rezultatul poate fi diferit: se formează un precipitat, apare o peliculă, fulgi mici plutesc sau se formează o soluție tulbure.

Mediul nutritiv solid este adesea folosit în cercetarea microbiologică pentru a studia proprietățile coloniilor bacteriene. Astfel de medii sunt întotdeauna transparente sau translucide, astfel încât este posibil să se determine corect culoarea și forma culturii de microorganisme.

Prepararea mediilor de cultură

Substraturile precum amestecurile de carne-peptonă pe bază de bulion, gelatină sau agar se prepară foarte ușor. Dacă trebuie să faceți un substrat solid sau semi-lichid, adăugați 2-3% sau, respectiv, 0,2-0,3% gelatină sau agar în lichid. Ele joacă un rol major în întărirea amestecului, dar nu sunt o sursă de nutrienți. Astfel, se obțin medii nutritive care sunt potrivite pentru creșterea culturilor bacteriene.

medii de diagnostic diferenţial, medii nutritive speciale utilizate pentru identificarea microorganismelor care au activitate biochimică selectivă faţă de anumite substanţe. În timpul dezvoltării lor, microbii, cu ajutorul enzimelor, descompun anumite substanțe conținute în mediu, ceea ce este determinat de modificările mediului.

O serie de microorganisme patogene descompun carbohidrații și alcoolii polihidroxici cu formarea de acizi și gaze (dioxid de carbon, hidrogen, metan), ceea ce indică faptul că aparțin unui anumit grup sau tip de bacterii. Pentru stabilirea acestor proprietăți se prepară D.-D. lichid sau semi-lichid. Cu. cu glucoza, lactoza, zaharoza, manoza si alti carbohidrati, alcooli polihidroxici (serie pestrita), cu indicatori (Andrade, Gissa), medii cu lapte. Capacitatea enzimatică a microbilor este determinată de apariția gazului sau de o schimbare a culorii indicatorului. Intensitatea formării acidului din glucoză se determină pe mediul Clark, formarea acetilmetilcarbonului - folosind reacția Voges-Proskauer, capacitatea amilolitică a microbilor - pe agar amidon. Proprietățile proteolitice ale microbilor sunt determinate pe medii care nu conțin glucoză și glicerol - gelatină de carne-peptonă, ser coagulat de cal, agar cu lapte. Gelatina carne-peptonă se inoculează prin înțepare pe fundul eprubetei, se incubează la 20-22((°))C și apoi se determină gradul de lichefiere a gelatinei. Capacitatea hemolitică a microbilor este determinată prin placare pe agar cu sânge sau bulion de sânge. Pentru determinarea activității reducătoare a microbilor se folosește D.-d. Cu. cu coloranți (albastru de metilen, turnesol, indidocarmină, tionină etc.). Pe măsură ce microbii cresc, are loc decolorarea completă sau parțială sau schimbarea culorii colorantului. Se mai folosesc medii cu nitrați, în care, sub influența enzimelor anumitor microbi, nitrații se reduc la nitriți și apoi la amoniac sau azot liber.

Există medii selective speciale pentru creșterea anaerobilor (mediul Kitta-Tarozzi etc.), identificarea unor bacterii intestinale, salmonela (Endo, Levin, Simmons, Ploskirev etc.), pentru determinarea mobilității microbilor, a relației lor cu oxigenul ( Mediul Peshkov ) etc. Agentul cauzator al tuberculozei este cultivat pe medii speciale de ouă de Petragnani, Livenstein-Jensen, Gelberg, agenți cauzali ai paratuberculozei - pe mediul Dubo-Smith, bruceloză - pe medii Albini, Weybridge, Korneeva; agentul cauzal al vibriozei - pe mediul GNKI. Micoplasmele sunt izolate și menținute cu cel mai mare succes pe mediul lui Edward și pe alte medii speciale; Leptospira - pe mediul seric de Terskikh, Ulenkhut, Lyubashenko, mediu de albumină GNKI. Agentul cauzator al putregaiului piciorului de oaie crește pe mediul creierului cu adăugarea de extract de corn copite și aminoacizi care conțin sulf; ciuperci - pe media Saouro, Capek etc.