Трепонемы микробиология. Микроскопическое исследование на бледную трепонему. Видео: сифилис в программе “Здоровье”

У больных с подозрением на сифилис исследованию на бледную трепонему подлежат все высыпания, особен но эрозивные и язвенные на коже и слизистых оболочках полости рта, половых органов и заднего прохода. Если ис следование высыпных элементов невозможно или за труднено, то прибегают к пункции лимфатических узлов.

Бледная трепонема располагается в тканевых щелях, между волокнами соединительной ткани, вокруг лимфатических и кровеносных сосудов, в стенках и даже про светах лимфатических капилляров. Материалом, который необходим для бактериологического исследования на бледную трепонему, является тканевая жидкость (се рум). Для получения тканевой жидкости из высыпных элементов сифилиса существует несколько методов.

Перед взятием материала для исследования поверхность эрозивных или язвенных элементов предварительно осторожно очищают ватным или марлевым тампоном, смоченным в изотоническом растворе хлорида натрия, после чего осушают, не допуская травмирования во избе жание кровотечения.

Через некоторое время на поверхности исследуемого элемента начинает выделяться довольно обильная ткане вая жидкость. Если этого не происходит, то можно осто рожно поглаживать поверхность эрозии или язвы бактериологической петлей или металлической лопаткой. Тканевую жидкость для исследования можно получить также путем сдавливания (массажа) пальцами в резино вой перчатке подозрительной эрозии или язвы, а также путем создания относительного вакуума с помощью би ровской баночки. При отсутствии эрозирования или изъ язвления высыпаний материал для исследования можно получить путем скарификации их поверхности скальпе лем. Если проводилось местное лечение или трепонема не найдена, то следует назначить больному на несколько дней влажновысыхающие повязки из изотонического раствора хлорида натрия и затем производить повторное исследование.

Пункцию лимфатического узла осуществляют у больного в положении лежа с соблюдением всех правил асеп тики. Для пункции используют острую иглу с тупо сре занным концом и шприц с хорошо притертым поршнем. Игла и шприц должны быть сухими. Исследуемый лим фатический узел фиксируют I и II пальцами левой руки, а правой со шприцем и надетой на него иглой делают по слойный прокол кожи и лимфатического узла. Прокол делают по длинной оси узла, продвигают иглу до конца узла, слегка массируя его. Затем медленно выдвигают иглу назад, одновременно отсасывая шприцем содержи мое лимфатического узла. При так называемой «пункции с обогащением» рекомендуется ввести в корковый слой лимфатического узла 0,1–0,2 мл стерильного изотониче ского раствора хлорида натрия, движением поршня шприца промассировать узел и затем отсосать содержи мое. Пунктат лимфатического узла используют для ис следования на бледную трепонему по обычной методике, причем перед исследованием его желательно не смеши вать на предметном стекле с изотоническим раствором хлорида натрия.

Наилучшим методом обнаружения бледных трепонем для диагностики сифилиса является микроскопическое исследование нативных (естественных, влажных) препа ратов в темном поле. Исследование в темном поле основа но на феномене Тиндаля: если в темное помещение про пустить через узкую щель солнечный свет, то начинают ярко светиться мелкие пылинки, невидимые при обыч ном освещении. Это происходит оттого, что находящиеся в воздухе пылинки отражают солнечные лучи в разных направлениях и часть этих лучей попадает в наш глаз. При микроскопическом исследовании в темном поле ис пользуется специальный конденсор, направляющий лучи света от осветителя под очень малым углом к плоскости столика микроскопа, вследствие чего свет не попадает в окуляр микроскопа, и поле зрения является темным. Ис следуемый объект отражает свет и становится четко ви димым на темном фоне. Исследование в темном поле микроскопа позволяет изучать бледную трепонему в жи вом виде, а также дифференцировать ее от других трепо нем как по морфологическим признакам, так и по харак терным особенностям движения.

Для получения затемненного поля зрения при отсутствии специального конденсора можно пользоваться спосо бом М. П. Архангельского. Для этого между двумя линза ми конденсора Аббе на нижнюю линзу накладывают кружок из плотной черной бумаги с таким расчетом, что бы по краю линзы оставался просвет в 2–3 мм. Для того, чтобы кружок не смещался, по его краю оставляют при вырезании четыре выступа такой длины, чтобы они упи рались в металлическую оправу линзы.

Приготовление препарата для исследования в затемненном поле зрения производится следующим образом. Каплю серозного экссудата, полученного с поверхности исследуемого элемента, помещают в центре тонкого пред метного стекла, предварительно обезжиренного смесью равных частей спирта и эфира. Для исследования в темном поле предметные стекла должны быть не толще

1,1–1,2 мм, без царапин, совершенно чистыми. Капля с исследуемым материалом не должна выходить за преде лы покровного стекла. Рядом с каплей серозного экссуда та наносят равную по величине каплю изотонического раствора хлорида натрия; быстро смешав обе капли, по крывают их покровным стеклом.

В некоторых лабораториях, однако, с успехом микроскопируют только серозный экссудат без добавления изо тонического раствора. На верхнюю линзу темнопольного конденсора наносят каплю иммерсионного масла или дистиллированной воды, к которой прижимают приго товленный препарат. Микроскопию проводят с объекти вом 40 и окуляром 10 или 5.

Источник света устанавливают так, чтобы световой луч падал на зеркало микроскопа.

После того как препарат помещен на столик микроско па и установлен источник света, тубус микроскопа с объ ективом под контролем глаза осторожно опускают почти до покровного стекла. Затем поворотами зеркала добива ются наиболее яркого освещения поля зрения и после этого, не отрывая глаза от окуляра, очень осторожно под нимают тубус микроскопа до тех пор, пока не появится темное поле со светящимися в нем твердыми частицами, находящимися в броуновском движении. Среди них мо гут обнаруживаться отдельные нейтрофилы, лимфоциты, эпителиальные клетки. Если препарат сильно загрязнен этими элементами, то лучше приготовить новый препа рат. Бледная трепонема в темном поле зрения представ ляется в виде нежной спирали или тонкого нежного пунк тира. Она слабо преломляет свет и имеет серебристый оттенок. Важное значение имеет оценка характерных для бледной трепонемы движений. При микроскопии не сле дует смешивать с трепонемой нити фибрина - длинные

(с большими завитками) образования, производящие впечатление подвижных за счет тока жидкости. Большей частью они очень тонки и неравномерны по толщине.

Бледную трепонему следует дифференцировать от других трепонем, прежде всего встречающихся на поло вых органах и в полости рта. На половых органах необхо димо иметь в виду T. refringens. Она значительно толще бледной трепонемы, сильнее преломляет свет, имеет не многочисленные неравномерные, грубые, широкие, более покатые и менее глубокие завитки. Концы ее заострены, движения резкие, беспорядочные. Также следует отли чать от бледной трепонемы T. balanitidis, похожую на T. refringens, отличающуюся значительной длиной, тол щиной и имеющую 6–10 завитков.

При исследовании материала, взятого из полости рта, необходимо учитывать наличие здесь следующих трепонем:

1) T. microdentium (T. denticola) - она короче и, как правило, толще бледной трепонемы, завитки ее не сколько заострены, угловаты, она сильнее прелом ляет свет, выглядит ярче, перемещается медленнее, сгибательные движения редки;

2) T. buccalis обладает 3–10 широкими, плоскими, не равномерными завитками, сильно преломляет свет, оживленно движется, концы ее тупые;

3) T. vincenti (из фузоспириллезного симбиоза) пред ставляет собой тонкую и нежную трепонему с пло скими и неравномерными завитками, иногда имею щую 2–3 пологих завитка; движения ее активны, но беспорядочны, она светится ярче бледной трепоне мы.

Бледные трепонемы плохо окрашиваются анилино выми красителями, но восстанавливают нитрат серебра в металлическое серебро, которое откладывается на поверхности трепонем и делает их видимыми при микро скопии. На этом феномене основано обнаружение блед ных трепонем в тканях.

Метод Levaditi и Manouelian. Кусочки кожи или других органов, толщиной 1–2 мм фиксируют в 10% форма лине в течение 24–48 ч, промываются 96% этанолом в те чение 12–16 ч, затем промывают дистиллированной водой до погружения кусочков на дно сосуда. После этого проводится импрегнация 1% раствором нитрата серебра с

10% раствором пиридина. Кусочки выдерживают в этой смеси (в темной банке с притертой пробкой) 2–3 ч при комнатной температуре, а затем 4–6 ч при температуре

50 °С в термостате. Затем препараты быстро промывают в 10% растворе пиридина, после чего в течение нескольких часов проводится восстановление серебра 4% пиррогало вой кислотой с добавлением 10% очищенного ацетона и

15% раствора пиридина.

Метод Морозова - один из наиболее быстрых мето дов серебрения бледных трепонем, дающих вполне удов летворительные результаты [Овчинников Н.М. и др.,

1987]. Для окраски по методу Морозова необходимы следующие реактивы:

Реактив № 1 - 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл 40% раствора формалина и 100 мл дистиллированной воды;

Реактив № 2 - 5 г танина, 100 мл жидкой карболовой кислоты и 100 мл дистиллированной воды;

Реактив № 3 - раствор нитрата серебра (в 100 мл дис тиллированной воды растворяют 5 г кристаллического нитрата серебра; из этого количества в отдельный сосуд отливают 20 мл; к остальным 80 мл раствора нитрата се ребра по каплям прибавляют крепкий водный раствор аммиака, пока образующийся желто коричневый, а за тем буро черный осадок не растворится и не останется лишь легкая опалесценция; если добавление аммиака вовремя не прекращено, то из оставшихся 20 мл раство ра нитрата серебра приливают по каплям этот раствор до появления легкой опалесценции), для окраски реак тив разбавляют дистиллированной водой 1:10.

Импрегнация. Тонкий препарат высушивают на воздухе, но лучше в термостате. На 1 мин наливают на препарат реактив

№ 1, затем жидкость сливают, препарат обмывают водой. Протравливают реактивом № 2 при подогревании до появле ния паров (1 мин). Тщательно промывают водой, наливают реактив № 3, слегка подогревают в течение 1–2 мин, пока ре актив не станет темно коричневым. Препарат вновь тщатель но промывают водой и высушивают. Микроскопируют с им мерсионной системой.

При этом методе импрегнации трепонемы коричневые или почти черные, у них сохраняются морфологические особенности.

Препараты не подлежат длительному хранению.

Окраска по Романовскому - Гимзе. Фиксацию мазка осуществляют в смеси Никифорова (этанол и эфир в рав ных объемах). После испарения с мазка фиксирующей жидкости производят окраску препарата краской Рома новского - Гимзы, разведенной из расчета 2 капли краски на 1 мл дистиллированной воды. Для этого 10–15 мл раз веденной краски наливают в чашку Петри, на две стек лянные палочки мазком вниз опускают предметное стек ло и оставляют препарат для окрашивания на 2–5 ч, в зависимости от интенсивности окрашивающей способ ности раствора. После окончания окрашивания предмет ное стекло с мазком осторожно промывают боковой струей воды. Высушивают препарат при комнатной температу ре. Микроскопическое исследование проводят в иммер сионной системе. При окраске препаратов по методу Ро мановского - Гимзы бледная трепонема приобретает розовый или розовато фиолетовый цвет, в то время как другие трепонемы окрашиваются в интенсивно синева тые тона.

Содержание статьи

Бледная трепонема

Морфология и физиология

T.pallidum имеет форму спирали, протоплшматический цилиндр, который скручен в 8-12 завитков. От концов клетки отходят 3 периплазматических жгутика. Бледная трепонема плохо воспринимает анилиновые красители, поэтому ее окрашивают краской Романовского-Гимза. Однако наиболее эффективным методом является ее изучение в темнопольном или фазовоконтрастном микроскопе. Микроаэрофил. На искусственных питательных средах не растет. Т. pallidum культивируют в ткани яичка кролика, где она хорошо размножается и полностью сохраняет свои свойства, вызывая у животного орхит. Антигены. Антигенная структура Т. pallidum сложная. Она связана с белками наружной мембраны, липопротеидами. Последние являются перекрестно реагирующими антигенами, общими для человека и крупного рогатого скота. Они используются в качестве антигена в реакции Вассермана для серодиагностики сифилиса.

Патогенность и патогенез

К факторам вирулентности бледной трепонемы относят белки наружной мембраны и ЛПС, проявляющие свои токсические свойства после освобождения из клетки. Вместе с тем, по-видимому, способность трепонемы при делении образовывать отдельные фрагменты, проникающие вглубь тканей, также можно отнести к факторам вирулентности. В патогенезе сифилиса различают три стадии. При первичном сифилисе наблюдается образование первичного очага - твердого шанкра в месте входных ворот инфекции, с последующим проникновением в регионарные лимфоузлы, где возбудитель размножается и накапливается. Первичный сифилис продолжается около 6 недель. Вторая стадия характеризуется генерализацией инфекции, сопровождающейся проникновением и циркуляцией возбудителя в крови, что сопровождается кожными высыпаниями. Продолжительность вторичного сифилиса у нелеченых больных колеблется в пределах 1-2 лет. В третьей стадии обнаруживаются инфекционные гранулемы (гуммы, склонные к распаду), локализующихся во внутренних органах и тканях. Данный период у нелеченых больных продолжается несколько лет и заканчивается поражением ЦНС (прогрессивный паралич) либо спинного мозга (спинная сухотка).

Иммунитет

При сифилисе имеет место гуморальный и клеточный иммунный ответ. Образующиеся антитела не обладают протективными свойствами. Клеточный иммунный ответ связан с фиксацией возбудителя и образованием гранулем. Однако элиминации трепонем из организма при этом не происходит. Вместе с тем неблагоприятные условия среды индуцируют образование трепонемами цист, которые локализуются в стенке кровеносных сосудов. Полагают, что это свидетельствует о переходе заболевания в стадию ремиссии. Наряду с цистами трепонемы образуют L-формы. При сифилисе формируется ГЗТ, которая может быть выявлена кожно-аллергической пробой с убитой взвесью трепонем. Полагают, что проявление третичного периода сифилиса связано с ГЗТ.

Экология и эпидемиология

Сифилис - типично антропонозная инфекция. Болеют только люди, которые являются резервуаром инфекции в природе. Передача инфекции происходит половым путем и значительно реже - через белье и другие предметы. Во внешней среде (воздух) трепонемы быстро погибают.

Сифилис и другие трепонематозы

Сифилис - хроническая инфекционная венерическая болезнь человека, имеет циклический прогрессирующее течение, поражает кожу, слизистые оболочки, внутренние органы и нервную систему. Возбудителем заболевания является Treponema pallidum.Различают три основные периоды развития сифилиса, методы лабораторной диагностики которых имеют свои особенности. В ранний период болезни материалом для лабораторной диагностики служит выделение из твердого шанкра, пунктат с лимфатических узлов, соскобы с розеол, сифилид подобное. При вторичном и третичном периодах исследуют сыворотку крови и ликвор.В связи с тем, что выделение чистых культур трепонем в обычных бактериологических лабораториях невозможно, во время первичного периода болезни (редко позже) проводят бактериоскопический метод диагностики. Начиная с вторичного периода, используют, в основном, серологические методы.

Бактериоскопическое исследования

Перед взятием патологического материала сначала сифилитическую язву протирают ватным тампоном, для удаления сального налета и контаминуючои микрофлоры. Затем дно твердого шанкра раздражают скальпелем или металлической лопаточкой или энергично сжимают язву с боков пальцами в резиновой перчатке к выделению раневого экссудата. При небольшомколичества прозрачной жидкости ее можно внести в каплю 0,85% раствора хлорида натрия. При невозможности взять материал со дна шанкра (фимоз, рубцевание язвы и др.) проводят пункцию регионарных лимфатических узлов.Каплю жидкости из язвы или пунктата наносят на тонкое предметное стекло (1,1-1,2 мм), накрывают покровным стеклом и исследуют в темном поле зрения (краще!), или с помощью фазово-контрастного или аноптрального микроскопа.Бледная трепонема в темном поле зрения имеет вид слегка блестящей тонкой нежной спирали с крутыми равномерными округлыми первичными завитками. Движения плавные, тем она изгибается под углом. Но особенно характерные для нее Маятникообразные колебания. Возбудитель сифилиса необходимо отличать от Treponema refringens (что колонизирует наружные половые органы), которая толще, грубее, с неравномерными крупными завитками и имеет активные беспорядочные движения, но не сгибается. Трепонемы фузосп-ирохетозного симбиоза отличаются тонким рисунком, пологими завитками и беспорядочным движением.При диагностике ротового сифилиса бледную трепонему следует дифференцировать и от зубных трепонем, особенно Т. dentium, а также от Т. buccalis. Первую из них вообще трудно отличить от сифилитического. Она, правда, короче, имеет 4-8 острых завитков, маятникообразное движение отсутствует. Т. buccalis толще, имеет грубые первоначальные завитки и беспорядочное движение.При любых сомнениях нужно учитывать, что все сапрофитные трепонемы, в отличие от бледной, хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Они не проникают в лимфатические узлы, поэтому исследования пунктатов имеет большую диагностическую ценность. Выявление в пунктате лимфатических узлов типовых трепонем беспрекословно подтверждает диагноз сифилиса.Итак, темнопольная исследования надавленные капли является наилучшим методом выявления возбудителя сифилиса. Его преимущества заключаются в том, что материал исследуют быстро, а морфология трепонем в живом состоянии наиболее характерна. Тушови мазки по методу Бурри теперь не используют.В случае невозможности провести исследование в темном поле зрения можно использовать различные методы окрашивания. Бледная трепонема плохо воспринимает анилиновые красители. Из многих предложенных способов окраски лучшие результаты получают при использовании окраски по Романовеьким-Гимзе. Изготовленные мазки фиксируют метиловым спиртом или в смеси Никифорова. Четкость результаты получают, когда краску Романовского-Гимзы наливают в препарат. Для этого в чашку Петри помещают обломки спичек, на них помещают предметное стекло мазком вниз и наливают краситель до тех пор, пока он смочите мазок. Время окраски при этом удваивают. При микроскопии бледные трепонемы имеют нежно-розовый цвет, а другие виды трепонем окрашиваются в синий или сине-фиолетовый цвет.Можно использовать и метод серебрения Морозовым. Трепонемы полностью сохраняют свои морфологические особенности и выглядят под микроскопом коричневыми или почти черными. Но посеребренные препараты долго не хранятся. В последнее время методы окрашивания трепонем применяют редко.Если начато лечение сифилиса химиопрепаратами, выявить возбудитель в патологических материалах даже с помощью темного поля зрения практически не удается. При получении отрицательного анализа его необходимо повторить.

Серологическая диагностика сифилиса

При проведении серологических реакций теперь используют следующие унифицированные в Украине методы исследований: реакции связывания комплемента (РСК), иммунофлуоресценции (РИФ), иммобилизации трепонем (PIT), микрореакцию преципитации (МПР) и иммуноферментный анализ (ИФА).На протяжении многих лет основной и наиболее распространенной реакцией считалась реакция связывания комплемента или реакция Вассермана (РВ, RW). Для ее постановки используют сыворотку крови больного сифилисом и спинномозговую жидкость при поражении нервной системы.Методика постановки реакции Вассермана не отличается от техники проведения РСК. Разница лишь в том, что для РО используют не только специфический трепонемный, а неспецифический кардиолипиновый антиген.l Взятие 5-10 мл крови из локтевой вены проводят натощак или не ранее 6 часов после приема пищи. Нельзя брать кровь у больных с повышенной температурой, после употребления алкоголя и жирной пищи, у беременных женщин за 10 дней до родов и рожениц. Добытую из крови сыворотку прогревают при температуре 56 ° С в течение 30 мин для инактивации собственного комплемента. РО обязательно ставят с двумя антигенами: специфическим и неспецифическим.Специфический ультраозвучений трепонемный антиген готовят из культур бледных трепонем (штамм Рейтера), выращенных в пробирках и подверженных действию ультразвука. Его выпускают в виде лиофильно высушенного порошка. Неспецифический кардиолипиновый антиген готовят путем спиртового экстрагирования липидов с бычьего сердца и очистки от балластных смесей, расфасовывают в ампулы по 2 мл. Для введения антигена в РО его титруют согласно данной инструкции. Непосредственно перед постановкой РВ проводят титрование комплемента и гемолитической сыворотки по такой же схеме, как и в РСК. Реакцию Вассермана ставят как качественным, так и количественным методом. Качественную реакцию проводят в трех пробирках с двумя антигенами по обычной схеме.Результаты реакции оценивают по 4 плюсовой системе: положительная реакция - когда есть полная или значительная задержка гемолиза (4 +, 3 +); слабоположительная реакция - частичная задержка гемолиза (2 +); сомнительная реакция - незначительная задержка гемолиза (1 +). В случае возникновения полного гемолиза РО считают отрицательной.Каждую сыворотку, которая дала положительную качественную реакцию, необходимо исследовать и количественным методом с последовательным ее разведением от 1:10 до 1:640.Титром исследуемой сыворотки (титр реагинов) считают то максимальное ее разведение, при котором наступает полная (4 +) или значка (3 +) задержка гемолиза. Количественный метод постановки РО имеет важное значение для оценки эффективности лечения сифилиса. Быстрое снижение титра реагинов указывает на успешную терапию. Если титр сыворотки долго не снижается, это свидетельствует об отсутствии эффективности применяемых препаратов и необходимость изменить тактику лечения.При пилозри на серонегативный первичный сифилис или скрытый, третичный или врожденный, рекомендуют ставить реакцию Вассермана на холоде по той же схеме. В случае подозрения на нейросифилис РО проводят со спинномозговой жидкостью, которую инактивируют, поскольку она не содержит собственного комплемента. В реакцию вводят неразведенный ликвор и в разведениях 1:2 и 1:5.Реакция Вассермана становится положительной через 2-3 недели после появления твердого шанкра. При вторичном сифилисе она выпадает положительной в 100% случаев, в третичном - в 75%.Кроме того, в комплексе серологических реакций (КСР) как скрининг-тест используют микрореакцию преципитации с плазмой крови или инактивированной сывороткой.

Микрореакция преципитации

Микрореакцию преципитации ставят с кардиолипиновым антигеном. Принцип реакции заключается в том, что при добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), который осаждается в виде хлопьев белого цвета. Пользуются такой методике: в лунку пластины вносят пипеткой три капли плазмы (или инактивированной сыворотки), затем добавляют одну каплю эмульсии стандартного кардиолипинового антигена. Компоненты реакции смешивают встряхиванием пластины в течение 5 мин, после чего добавляют три капли 0,9% раствора хлорида натрия и оставляют при комнатной температуре еще на 5 мин. Обязательном контроле со слабоположительный сывороткой крови. Результаты оценивают невооруженным глазом над искусственным источником освещения. При появлении в лунке крупных хлопьев реакцию считают положительной (4 +, 3 +), средних и мелких - как слабоположительные (2 +, 1 +). При отрицательном результате преципитат не образуется.Микрореакцию преципитации можно проводить и количественным методом для установления титра преципитирующих антител и оценки на этой основе эффективности лечения. Более высокие титры МРП получают с плазмой, чем с сывороткой. За рубежом аналогом МРП с сывороткой больного является VDRL (Veneral disease research laboratoiy), а с плазмой - RPR (Rapid plasma reagin).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

К группе специфических реакций, которые широко употребляются для серологической диагностики сифилиса, относится непрямая реакция иммунофлюоресценции. Как антиген, в ней используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из паренхимы яичек кролика на 7-й день после заражения. Реакцию ставят в двух модификациях: РИФ-АБС и РИФ-200. В первом варианте используют сорбент антител (соникат) - ультраозвучений трепонемный антиген для РСК. Его выпускает Каунасское предприятие по производству бактерийных препаратов (Литва). При варианте РИФ-200 сыворотку больного разводят в 200 раз с целью снять влияние групповых протитрепонемних антител.Постановку РИФ-АБС проводят на тонких, хорошо обезжиренных предметных стеклах. На обратной стороне стекол стеклорезом обозначены 10 кружочков диаметром 0,7 см. В рамках кружка на стекло наносят антиген - взвесь бледных трепонем - в таком количестве, чтобы в поле зрения их было 50-60. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем и 10 мин в ацетоне. В отдельную пробирку вносят 0,2 мл сорбента (соникату) и 0,5 мл сыворотки крови больного, хорошо перемешивают. Смесь наносят на мазок (антиген) так, чтобы равномерно его покрыть, выдерживают 30 мин во влажной камере при 3 7 ° С (II фаза реакции). После этого мазок промывают фосфатным буфером, высушивают и наносят на него антишобулинову флуоресцентных сыворотку на 30 мин, ставят во влажную камеру при 37 ° С (II фаза). Препарат вновь промывают фосфатным буфером, высушивают и исследуют под люминесцентным микроскопом.При положительной реакции бледные трепонемы излучают золотисто-зеленый свет, при отрицательной - не светятся.Техника постановки РИФ-200 такое же, как и РИФ-АБС, только сыворотку крови больного предварительно разводят в 200 раз фосфатным буфером. При проведенииреакции иммунофлюоресценции со спинномозговой жидкостью больного сифилисом нервной системы используют РИФ-ц и РИФ-10, т.е. ликвор вводят в реакцию неинактивованим и разведенным, или разведенным 1:10.

Реакция имобилизации бледных трепонем (PИT)

Реакция имобилизации бледных трепонем (PИT) основан на феномене потери их подвижности в присутствии иммобилизирующие протитрепонемних антител сыворотки больного и комплемента в условиях анаэробиоза. Как антиген в реакции используют взвесь бледных трепонем из тестикулярной ткани кролика, зараженного лабораторным штаммом Никольса. Взвесь разводят стерильным 0,85% раствором хлорида натрия так, чтобы в поле зрения было 10-15 спирохет.Для проведения реакции в стерильной пробирке смешивают 0,05 мл сыворотки крови больного, 0,35 мл антигена и 0,15 мл комплемента. Опыт сопровождают контролями сыворотки, антигена и комплемента. Пробирки помещают в анаеростат, создают анаробни условия и выдерживают в термостате 18-20 ч при температуре 35 ° С. Затем из каждой пробирки готовят препарат надавленные капли, подсчитывают не менее 25 трепонем и отмечают, сколько из них подвижных и сколько неподвижных. Процент специфической иммобилизации бледных трепонем подсчитывают по формуле: х = (А-В) / В * 100, где X - процент иммобилизации, А - число подвижных трепонем в контрольной пробирке, В - число подвижных трепонем в опытной пробирке. Реакция считается положительной, когда процент иммобилизации составляет 50 и более, слабоположительный - от 30 до 50, сомнительной - от 20 до 30 и отрицательной - от 0 до 20.В практических лабораториях используют более простой меланжерний метод PIT за М.М. Овчинниковым. Анаэробные условия опыта создаются помещением реагирующей смеси (сыворотки, антиген, комплемент) в меланжеры, оба конца которого закрывают резиновым кольцом. Меланжерна методика позволяет обойтись без сложного оборудования и аппаратуры для создания анаэробиоза, но дает такие результаты, которые не посту паються классической микроанаеростатний методике.Реакции иммобилизации трепонем и иммунофлуоресценции считают наиболее специфичными в серологической диагностике сифилиса. И все же, PIT, несмотря на ее специфичность, не рекомендуют для использования в широкой практике из-за трудоемкости постановки.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят как с кадриолипиновим антигеном (неспецифическая, отборочная реакция), так и трепонемным (специфическая реакция), которая подтверждает диагноз сифилиса.Принцип непрямого метода ИФА заключается в том, что в антигена, адсорбированного на твердой фазе в лунках планшета вносят исследуемую сыворотку. Если она содержит антитела против трепонем, образуется комплекс антиген-антитело (II фаза). После отмывания несвязанных неспецифических антител в лунки вносят антиглобулинову сыворотку, конъюгированные с ферментом (чаще всего с пероксидазой хрена). Конъюгат прочно присоединяется к комплексу антиген-антитело (II фаза).После отмывания несвязанного конъюгата в лунки добавляют окрашивающий субстрат ОФД - ортофенилендиамин (III фаза). Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя серную кислоту. Для контроля ставят такие же пробы с положительным и заведомо отрицательной сыворотками.Учет результатов анализа проводят с помощью фотометра, который определяет оптическую плотность в двухволновом режиме (492 нм и 620 нм). Для постановки реакции ензиммичених антител, кроме фотометра, нужны одно-и восьмиканальные автоматические пипетки с полипропиленовым наконечником и соответствующие наборы диагностических тест-систем.Метод ИФА находит широкое применение в серологической диагностике сифилиса. Он одинаково эффективен для выявления болезни в инкубационном периоде (через 1-2 недели после инфицирования), при клинических проявлениях болезни и скрытых его формах. Очень часто ИФА используют при скрининговых обследованиях населения, особенно на станциях переливания крови.В лабораторной практике иногда применяют также реакцию иммунной прилипания (РИП) и реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА). Первая из них основывается на том, что патогенные тестикулярные трепонемы штамма Никольса при смешивании с сывороткой больного в присутствии комплемента и эритроцитов человека прилипают к поверхности красных кровяных телец. РНГА достаточно широко используется для диагностики сифилиса благодаря своей методической простоте. Она становится положительной уже через три недели после заражения. Положительный результат реакции остается годами после выздоровления. Аналогом этой реакции за рубежом является ТРНА (Treponema pallidum haemoagglutination).

Treponema – род бактерий, объединяющий многочисленные виды, из которых самым распространенным является возбудитель сифилиса – treponema pallidum (трепонема паллидум, бледная трепонема). В этот род также входят возбудители фрамбезии и пинты. Treponema pallidum является спиралевидной бактерией семейства Spirochaetiaceae (спирохеты), вызывающей инфекционное венерическое заболевание - . Патология отличается волнообразным течением и проявляется характерной клиникой. Заражение происходит преимущественно половым путем, благодаря чему сифилис относится к ИППП.

В настоящее время в мире регистрируется огромное количество венерических заболеваний, которые представляют реальную угрозу для жизни человека. Treponema pallidum – опасный микроб, вызывающий системное заболевание, поражающее кожу и внутренние органы. На месте внедрения спирохеты образуется первичный патологический очаг – . Затем на коже появляются сифилитические высыпания, увеличиваются регионарные лимфатические узлы. При отсутствии адекватной терапии поражаются внутренние органы, развиваются необратимые изменения, возможен летальный исход.

Treponema pallidum

Морфология

Treponema pallidum - грамотрицательный микроорганизм, имеющий форму тонкой спирали, скрученной в 8-12 мелких завитков. Свое название бледная трепонема получила благодаря способности не воспринимать обычные лабораторные красители.

Спирохета является строгим анаэробом, хорошо растущим в бескислородной среде. Но не смотря на это, жизнеспособность бактерий сохраняется на окружающих бытовых предметах в течение 3 и более дней. Трепонема имеет жгутики и фибриллы. Благодаря им и собственным сокращениям клетки бактерия совершает поступательные, вращательные, сгибательные, волнообразные, винтообразные и контрактильные движения. Она быстро проникает в живые клетки и стремительно размножается в них поперечным делением.

Бледная трепонема имеет трехслойную клеточную стенку, цитоплазму и органеллы: рибосомы, мезосомы, вакуоли. Рибосомы синтезируют белки, а мезосомы обеспечивают дыхание и обмен веществ. Ферменты и антигены содержатся в цитоплазматической мембране. Тело бактерии покрыто слизистой бесструктурной капсулой, выполняющей защитную функцию.

Физические свойства

Микробы устойчивы к низким температурам и чувствительны к высоким. При нагревании они гибнут в течение 20 минут, при высыхании в течение 15 минут, а при кипячении – мгновенно. Антисептики и дезинфектанты быстро уничтожают бледную трепонему. Губительное действие на бактерию оказывают: ультрафиолет, свет, спирт, щелочи, уксус, мышьяк, ртуть, хлорсодержащие дезинфицирующие средства. Treponema pallidum устойчива к некоторым антибиотикам.

Бледная трепонема проявляет свои патогенные свойства во влажной и теплой среде. В организме человека излюбленным местом размножения являются лимфатические узлы. На стадии вторичного сифилиса микробы концентрируются в крови и проявляют свои патогенные свойства.

Культуральные свойства

Трепонема паллидум не растет на искусственных питательных средах, в культуре клеток и куриных эмбрионах. Ее культивируют в яичках кролика. В этих клетках микроб хорошо растет и размножается, полностью сохраняя свои свойства и вызывая у животного орхит.

Существуют обогащенные питательные среды, предназначенные для выделения чистой культуры. Микробы на них растут под толстым слоем вазелинового масла. Таким способом получают антитела, необходимые для постановки специфических реакций на сифилис.

Трепонемы растут на кровяном или сывороточном агаре в бескислородной среде. При этом они теряют свои патогенные свойства, но сохраняют антигенные. Патогенные трепонемы способны ферментировать маннит, утилизировать лактат и образовывать специфические метаболиты.

Патогенность

К факторам и компонентам патогенности и вирулентности бактерий относятся:

Белки-адгезины, обеспечивающие фиксацию микроба на клетке-хозяина,
Миофибриллы, способствующие глубокому проникновению в организм и миграции бактерии в теле хозяина,
Образование L-форм,
Липополисахариды наружной мембраны,
Фрагменты болезнетворной клетки, проникающие вглубь тканей,
Способность внедряться в межклеточные соединения эндотелия,
Антигенная изменчивость.

Трепонема паллидум оказывает прямое токсическое действие на синтез макромолекул – ДНК, РНК и белков. Антигены Т. pallidum используются в реакции Вассермана для серодиагностики сифилиса. При неблагоприятных условиях спирохета трансформируется в L-формы, которые обеспечивают ее устойчивость к антибактериальным средствам и антителам.

Эпидемиология

Сифилис - строгий антропоноз. Инфекция персистирует только в организме человека, который является ее естественным резервуаром в природе. Входными воротами инфекции являются: поврежденный плоскоклеточный или цилиндрический эпителий ротовой полости или половых органов.

Распространение инфекционных агентов происходит:

Половым путем во время полового акта через сперму,
Бытовым путем через белье, средства гигиены, косметические принадлежности, при поцелуе,
Вертикальным путем от инфицированной матери ребенку во время родов, а также через молоко при кормлении грудью,
Трансплацентарным путем на поздних сроках беременности,
Гематогенным путем при прямом переливании крови, во время операций, при использовании общего шприца у наркоманов.

Риск инфицирования повышен у медицинских работников – стоматологов, косметологов. Заражение происходит при проведении медицинских манипуляций и процедур, повреждающих кожные покровы. Заражаются treponema pallidum лица, ведущие беспорядочную половую жизнь, имеющие несколько половых партнеров, пренебрегающие барьерными методами контрацепции. Для того, чтобы произошло инфицирование, у больного в секрете должно быть много бактерий, а у партнера - должны присутствовать повреждения на слизистой оболочке.

первые проявления болезни

Больной максимально заразен в периоды первичного и вторичного сифилиса, когда на коже и слизистой половых органов появляются первые признаки болезни. В это время в окружающую среду выделяется много спирохет.

В настоящее время регистрируется большое число больных с экстрагенитальными шанкрами, расположенными на слизистой рта, глотки, ануса. У них высыпания локализуются на лице, сифилиды – на ладонях и подошвах. Третичный период сифилиса в последнее время развивается в очень редких случаях и протекает практически бессимптомно.

Симптоматика

Инкубация характеризуется миграцией бактерий по лимфатическим и кровеносным сосудам и их активным размножением в лимфоузлах. Продолжительность периода - от 3 недель до 3 месяцев.

Врожденный сифилис развивается в результате внутриутробного заражения плода. Эта тяжелейшая патология проявляется характерной триадой симптомов у ребенка: врожденной глухотой, кератитом, гетчинсоновыми зубами.

Диагностика

Диагностика сифилиса включает опрос и осмотр пациента, сбор анамнестических сведений, а также клинические испытания, которые играют важную роль в обнаружении бледной трепонемы и постановке диагноза.

Микроскопическое исследование биоматериала. Бактериоскопию мазка-отпечатка шанкра или биоптата лимфатического узла проводят в первые 4 недели болезни. Для получения качественного мазка поверхность эрозии и язвы обрабатывают физраствором, производят соскоб и из полученного материала готовят препарат для микроскопии. Мазок окрашивают по Романовскому-Гимзе. Трепонема имеет бледно-розовый цвет. Живые микробы в неокрашенном и нефиксированном мазке не видны в световой микроскоп. Для их обнаружения применяют темнопольную или фазовоконтрастную микроскопию. Для проведения темнопольной микроскопии берут материал из сифилитической язвы и исследуют его в специальном аппарате. Бактерия обладает способностью преломлять свет: в микроскопе она имеет вид белой спиралевидной полоски. Для обнаружения трепонем в различных клинических материалах применяется также люминесцентная микроскопия.

Лечение

Лечением сифилиса занимается врач-дерматовенеролог. Он подбирает терапию индивидуально с учетом стадии, клиники болезни и особенностей пациента. Комплексное лечение способствует полному выздоровлению, которое должно подтверждаться лабораторно.

Лечение сифилиса этиотропное, направленное на уничтожение возбудителя – treponema pallidum. Больным назначают большие дозы антибиотиков, к которым чувствителен данный микроб. Обычно используют пенициллины «Бензилпенициллин», тетрациклины «Доксициклин», макролиды «Кларитромицин», «Сумамед», цефалоспорины «Цефазолин», фторхинолоны «Ципрофлоксацин». Антибактериальную терапию продолжают 2 месяца. Лечение беременных женщин проводят также.

Иммуностимуляция, витаминотерапия, физиопроцедуры дополняют этиотропное лечение и помогают больным восстановиться после болезни. Превентивная терапия проводится половому партнеру и лицам, контактировавшим с больным.

Видео: дерматовенеролог о лечении сифилиса

Профилактика

Профилактические мероприятия заключаются в соблюдении личной гигиены, использовании отдельного белья и посуды, индивидуальных косметических средств. Рекомендуется сразу после незащищенного полового акта обработать раствором хлоргексидина или альбуцида половые органы или другие части тела, с которыми произошел контакт. Эти средства необходимо иметь в домашней аптечке.

С профилактической целью обследуют:

Доноров,
Беременных женщин,
Работников детских садов, школ, общепита и лечебно-профилактических учреждений,
Больных, поступающих на стационарное лечение.

Современная противомикробная терапия позволяет избавиться от патологии и делает прогноз заболевания благоприятным. Только врач-дерматовенеролог сможет подобрать правильное и достаточное лечение, соответствующее стадии болезни. Заниматься самолечением сифилиса категорически запрещено. Не до конца излеченная патология может перейти в хроническую форму. Такой больной опасен для окружающих лиц.

Сифилис – социальный недуг, к лечению которого нужно подходить серьезно и ответственно.

Видео: сифилис в программе “Здоровье”

Treponema pallidum - возбудитель сифилиса включен в род Treponema (от лат. trepo - поворачивать, nemo - нить).

Т. pallidum открыта Ф. Шаудином в 1905 г. Большой вклад в изучение сифилиса внесли И. И. Мечников, П. Эрлих, Д. К. Заболотный и др.

Морфология . Т. pallidum - спиралевидная нить размером 8-18 × 0,08-0,2 мкм с мелкими, равномерными завитками. Число завитков 12-14. Концы трепонемы заострены или закруглены. Трепонемы подвижны. Обладают четырьмя видами движения. По Романовскому - Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет, поэтому они называются Т. pallidum - бледная трепонема. Плохое окрашивание объясняется малым содержанием нуклеопротеидов. Спирохеты можно выявлять в препаратах, окрашенных по Бурри, серебрением. Кроме того, их изучают в живом состоянии - в темном поле.

Возбудители сифилиса спор и капсул не имеют (см. рис. 4).

Культивирование . Бледные трепонемы очень требовательны к питательным средам. На искусственных питательных средах они растут только в присутствии кусочков мозга или почек кролика и асцитической жидкости. Растут медленно, 5-12 дней при температуре 35-36° С в анаэробных условиях. Бледные трепонемы хорошо размножаются в курином эмбрионе (поперечным делением). При выращивании на искусственных питательных средах трепонемы теряют вирулентность. Такие культуры называются культуральными. Культуры, выращенные в курином эмбрионе, называют тканевыми. Они обычно сохраняют вирулентность.

Ферментативными свойствами трепонемы не обладают. Однако культуральные штаммы различаются между собой по способности образовывать индол и сероводород.

Токсинообразование . Не установлено.

Антигенная структура . Бледная трепонема содержит несколько антигенных комплексов: полисахаридный, липидный и протеиновый. Серогруппы и серовары не установлены.

Устойчивость к факторам окружающей среды . Бледные трепонемы малоустойчивы. Температура 45-55° С губит их через 15 мин. К низким температурам они устойчивы. При замораживании сохраняются до года. Спирохеты чувствительны к солям тяжелых металлов (ртути, висмута, мышьяка и др.). Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их в течение нескольких минут. Они чувствительны к бензилпенициллину, бициллину и др. Под влиянием некоторых факторов внешней среды и антибактериальных препаратов трепонемы могут образовывать цисты. В такой форме они длительно находятся в организме в латентном состоянии.

Восприимчивость животных . В естественных условиях животные сифилисом не болеют. Однако на обезьянах, как показали И. И. Мечников и Э. Ру, можно воспроизвести клиническую картину сифилиса: на месте введения образуется твердый шанкр. В настоящее время показано, что при заражении кроликов, морских свинок на месте введения или в другом месте на коже образуются язвы. На кроликах путем пассажей можно длительное время сохранять выделенный штамм трепонем.

Источники инфекции . Больной человек.

Пути передачи . Контакт бытовой (прямой контакт), преимущественно половой путь. Иногда сифилис может передаваться через предметы (посуду, белье). От больной сифилисом матери заболевание передается через плаценту ребенку (врожденный сифилис).

Патогенез . Входными воротами являются слизистые оболочки половых путей и ротовой полости.

Первичный период - спирохеты попадают на слизистую оболочку, и после инкубационного периода (в среднем 3 нед) на месте внедрения образуется язва, которая характеризуется плотными краями и дном - твердый шанкр. Образованию твердого шанкра сопутствует увеличение лимфатических узлов. Первичный период продолжается 6-7 нед.

Вторичный период - возбудители сифилиса по лимфатическим и кровеносным путям распространяются по всему организму. При этом на коже и слизистых оболочках образуются розеолы, папулы, везикулы. Продолжительность этого периода - 3-4 года.

Третий период - развивается при нелеченом сифилисе. В этот период в органах, тканях, костях, сосудах образуются грануляционные разрастания - гуммы или гуммозные инфильтраты, склонные к распаду. Этот период может продолжаться несколько лет (в скрытой форме). Больной в этот период незаразен. При нелеченом сифилисе (в некоторых случаях), спустя много лет, может наступить поражение центральной нервной системы: при поражении головного мозга - прогрессивный паралич, при поражении спинного мозга - спинная сухотка. Эти заболевания возникают при локализации трепонем в мозговой ткани, что приводит к тяжелым органическим и функциональным изменениям в организме.

Иммунитет . Естественного иммунитета нет. При заболевании сифилисом развивается "нестерильный" инфекционный иммунитет. Его называют шанкерный, так как при повторном заражении твердый шанкр не образуется, но все последующие периоды развиваются. При сифилисе обнаруживают IgC и IgM, а также реагины IgE, которые в присутствии кардиолипидного антигена связывают комплемент.

Профилактика . Санитарно-просветительная работа, раннее выявление больных сифилисом. Специфическая профилактика. Не разработана.

Лечение . Пенициллин, бициллин, биохинол и др.

Контрольные вопросы

1. Опишите морфологию спирохет и методы окраски.

2. Что такое твердый шанкр?

3. Какой материал для исследования Вы будете брать в разные периоды заболевания сифилисом?

4. Каков иммунитет при сифилисе?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выявление бледной трепонемы и серодиагностика.

Материал для исследования

1. Содержимое твердого шанкра (первичный период).

2. Содержимое розеол, папул, везикул (вторичный период).

3. Кровь (вторичный, третий и четвертый периоды).

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

3. Серологический: 1) реакция Вассермана (РСК);

2) осадочные реакции.

4. Реакция иммобилизации трепонем (РИТ).

Серологическая диагностика

Реакция Вассермана . Реакцию ставят по принципу реакции связывания комплемента (табл. 52). Отличается она тем, что при реакции Вассермана может быть использован неспецифический антиген. Например, липоидный экстракт из бычьего сердца - кардиоантиген. Ввиду неспецифичности антител, реагирующих с этим антигеном, их называют реагинами. Реакция с неспецифическим антигеном объясняется тем, что в сыворотке крови больного повышается содержание глобулинов и изменяется степень их дисперсности. Глобулины, вступая в соединение с липидными экстрактами, образуют комплекс, который связывает комплемент, и поэтому гемолиз не происходит (в гемолитической системе). Отсутствие гемолиза - положительная реакция - серологически подтверждает диагноз "сифилис". При постановке серологических реакций нужно использовать также специфические антигены из тканевых трепонем и культуральные.

Примечание. 1) ++++ полная задержка гемолиза; - гемолиз; 2) антиген № 1 неспецифический (липоидная фракция бычьего сердца); 3) антигены № 2 и 3 специфические, приготовленные из культур трепонем.

Осадочные реакции . 1. Реакция Кана. Сыворотку больного инактивируют при 56° С 30 мин. К антигену (экстракт липидов бычьего сердца) прибавляют 0,6% холестерина для повышения чувствительности реакции (табл. 53).

Учет результата: появление преципитации отмечается как положительная реакция .

2. Реакция Закса - Витебского (цитохолевая осадочная реакция) является модификацией реакции Кана. Авторы применили более концентрированный антиген, к которому прибавлен холестерин, что способствует более быстрому образованию преципитата.

Реакция иммобилизации трепонем (РИТ) . Это наиболее специфичная реакция в диагностике сифилиса.

В настоящее время разработана методика этой реакции: взвесь трепонем получают из измельченного яичка кролика, зараженного Т. pallidum, и сохраняют в специальной среде, не угнетающей подвижность трепонем. В пробирку вносят 1,7 мл взвеси тканевых трепонем, добавляют 0,2 мл испытуемой сыворотки, 0,1 мл свежего комплемента.

Контроли: в 1-ю пробирку вместо испытуемой сыворотки вносят сыворотку здорового лица; во 2-ю - наливают инактивированную сыворотку морской свинки. Все пробирки помещают в эксикатор или анаэростат, заполняют их смесью газов (1 объем углекислоты и 19 объемов азота) и ставят в термостат при 35° С. Затем исследуемый материал наносят на стекло и изучают подвижность трепонем в темном поле. Принцип реакции заключается в том, что сыворотка больного сифилисом в присутствии комплемента угнетает движение бледной трепонемы. Определяют процент иммобилизованных трепонем.

Результат считают положительным, если иммобилизованных трепонем выше 50%; слабоположительным - от 30-50%; отрицательным - ниже 20%.

Контрольные вопросы

1. Какой материал используют для лабораторной диагностики сифилиса в разные периоды заболевания?

2. Каковы методы лабораторного исследования при диагностике сифилиса?

3. Какими антигенами нужно пользоваться при постановке реакции Вассермана?

4. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции иммобилизации трепонем (РИТ)? Какой материал берут у обследуемого, что в нем определяют?

Мир микроорганизмов чрезвычайно разнообразен и систематизирован учёными-исследователями. Изучение живого микромира активно велось в прошлом столетии. Однако, многие болезни до конца не изучены и в нынешнем веке.

Так, например, до сих пор не существует единого мнения по поводу происхождения сифилиса. Эта «французская болезнь», как наиболее древнее инфекционное заболевание человечества, по утверждению М. В. Милича, возникла на Земле одновременно с появлением человека.

К слову, М.В. Милич - ведущий сифилидолог страны периода 60-80-х годов, автора многочисленных книг и монографий, посвященных сифилису.

Официально открытие возбудителя сифилиса относится к 1905 году. Немецкие микробиологи Ф. Шаудин и Э. Гофман определили ряд морфологических, культуральных, биохимических свойств бледной трепонемы, а также некоторые особенности данного микроорганизма, положенные в основу таксономии.

В данной статье подробно разберем особенности строения, антигенную структуру, биохимические и физиологические свойства инфекционного агента, вызывающего сифилис.

Итак, единственным возбудителем сифилиса человека является Treponema pallidum (бледная трепонема). Она относится к порядку Spirochaetales типа Spirochaetes.

Показать всё

1. Морфология Treponema pallidum

Клетки бледных трепонем имеют длину 6-15 мкм, ширину 0,1-0,2 мкм, представляют собой протоплазматический цилиндр (цитоплазма, окружённая цитоплазматической мембраной), скрученный в спираль. Иногда клетка микроорганизма напоминает штопорообразную тонкую нить.

Рисунок 1 - Строение бледной трепонемы. OM, наружная мембрана; Ef (эндофлагелла или периплазматические жгутики); LP 1, 2, липопротеины; Pg - пептидогликан; CM - цитоплазматическая мембрана. (Из Cox DL, Chang P, McDowall AW и Radolf JD: Наружная мембрана, а не оболочка белков хозяина, ограничивает антигенность вирулентной трепонемы паллидум. Infect Immun 60: 1076)

Число завитков - от 8 до 14 штук. Завитки, одинаковые по размерам, сохраняются при любых движениях клетки, даже при движении трепонемы вдоль или между других клеток, например, форменных элементов крови.

Рисунок 2 - Электронная микрофотография Treponema pallidum. (From Fitzgerald TJ, Cleveland P, Johnson RC et al: Сканирующая электронная микроскопия Treponema pallidum (штамм Nichols), прикрепленная к культивируемым клеткам млекопитающих. J Bacteriol 130: 1333, 1977.)

С полюсов клетки, между оболочкой и цитоплазмой располагаются фибриллы. Одна часть фибриллы зафиксирована, вторая часть остаётся свободной. Фибриллы образуют двигательный аппарат трепонемы паллидум, позволяющий осуществлять несколько типов движения в жидкой среде:

1 Перемещение.
2 Вращение вдоль оси.
3 Сгибание.

Treponema pallidum является грамотрицательным микроорганизмом. Однако, по Грамму не окрашивается, так как имеет в своём составе гидрофобные частицы, не восприимчивые к анилиновым красителям.

При окраске по Романовскому-Гимзе приобретает слабо – розовый цвет. Эта особенность послужила основанием для видового названия возбудителя сифилиса.

Treponema pallidum subsp pallidum - это требовательный к условиям окружающей среды микроорганизм, который имеет узкие оптимальные диапазоны pH (7,2-7,4), Eh (-230-240 мВ) и температуру (30-37°C). Трепонемы быстро инактивируются слабым теплом, холодом, высушиванием и большинством дезинфицирующих средств.

Традиционно трепонемы паллидум считались строгими анаэробами, но теперь они известны как микроаэрофильные бактерии.

2. Культуральные и биохимические свойства

Несмотря на интенсивные усилия в течение последних 75 лет, T pallidum pallidum не были успешно культивированы in vitro. Жизнеспособные микроорганизмы могут сохраняться в течение 18-21 дней в комплексных средах, а ограниченная репликация была получена совместным культивированием с клетками культуры ткани. Другие три патогенных вида трепонем также не были успешно выращены in vitro.

При культивации бледная трепонема теряет свою патогенность, но, тем не менее, сохраняет некоторые антигенные свойства (эту особенность используют для постановки реакции Вассермана).

Культуру, в основном, культивируют в тестикулах кроликов. В ткани тестикул трепонема паллидум размножается, вызывая орхит у многострадальных животных.

Размножается Т. pallidum бинарным поперечным делением при температуре около 37˚С. Время генерации in vivo относительно велико (30 часов).

Трепонемы малоустойчивы во внешней среде.

1 Вне человеческого организма живут несколько минут, после высыхания погибают. Так, при температуре 40˚С трепонемы погибают в течение нескольких часов, при температуре свыше 50˚С - в течение 15 минут.
2 При неблагоприятных условиях микроорганизм образует L–формы, а также цисты, которые, в свою очередь, способны, к образованию вновь спиралевидных форм.

По типу метаболизма Т. pallidum является хемоорганогетеротрофом. Это означает, что в качестве источника энергии для жизнедеятельности бледная трепонема использует органические вещества и энергию химических связей.

Ввиду неспособности к существованию Т. pallidum in vitro биохимические свойства изучены не достаточно хорошо.

3. Антигенная структура

Т. pallidum имеет мало изученную антигенную структуру. Она представлена специфическим термолабильным протеиновым антигеном, неспецифическим липоидным антигеном, а также антигеном полисахаридной природы.

Проще говоря, антигены бледной трепонемы – это преимущественно белки, липиды и полисахариды наружной мембраны клетки.

Важную роль играет липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерии. Он выполняет антигенную и токсическую функции, являясь эндотоксином бледной трепонемы.

Липоидный антиген сходен с тканевым экстрактом бычьего сердца – кардиолипином.

4. Факторы патогенности

Как и биохимические свойства, факторы патогенности трепонем изучены не достаточно хорошо.

После попадания в макроорганизм Т. pallidum высвобождает специфические белки, липополипротеины и липополисахариды, проявляющие токсические свойства после ее гибели.

Липополипротеины участвуют в активации иммунной системы, а протеины сходны по отдельным свойствам с бактериальными гемолизинами.

К факторам патогенности бледной трепонемы относят способность высвобождать эндотоксины и липидные антигены по все видимости, из липидов митохондриальных мембран, обладающие свойством аутоантигенов.

Т. pallidum, являясь грамотрицательной бактерией, не продуцирует экзотоксины, однако обладает токсической активностью в отношении некоторых клеток, например, нейробластов.

5. Виды иммунитета

В ответ на внедрение возбудителя сифилиса в организм человека возникает клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Клеточный иммунитет связан с фиксацией бледной трепонемы к клеткам органов и тканей и последующей активацией макрофагов, Т-лимфоцитов. При этом из организма человека возбудитель сифилиса не элиминируется.

Гуморальный иммунитет характеризуется образованием специфических иммуноглобулинов. На ранних этапах инфекции в организме человека образуются IgM. По мере прогрессирования инфекции активируется синтез IgG. IgA синтезируется в малых количествах. Вопросы участия и синтеза IgD и IgE не достаточно хорошо изучены.

6. Чувствительность к антибактериальным препаратам

Возбудитель сифилиса чувствителен практически ко всем антибиотикам, но к препаратам выбора относятся пенициллины.

В основе клеточной стенки бледной трепонемы лежит пептидогликан, выполняющий защитную функцию. Этот пептидогликан является «мишенью» для основного антибактериального препарата, предназначенного для лечения сифилиса – пенициллина. Антибиотики группы пенициллинов разрывают тетрапептидные связи пептидогликана.

При воздействии антибиотика на растущую бледную трепонему (возможно, при длительном воздействии) образуется L-форма бактерии. Такая форма лишена клеточной стенки, но всё ещё способна к размножению.

Определение чувствительности бледной трепонемы к антибактериальным препаратам не проводится.

7. Лабораторная диагностика сифилиса

Лабораторные методы диагностики сифилиса условно можно разделить на 2 группы:

1 Выявление самого возбудителя заболевания из биологических препаратов (содержимое шанкра, гнойное отделяемое папул, пунктаты из лимфатических узлов).
2 Серологические реакции.

Серологические реакции используются как для верификации диагноза, так и для оценки эффективности терапии сифилиса. Особенность серологии сифилиса сводится к отсутствию положительных результатов анализов на раннем этапе заболевания.

Объясняется это достаточно просто. Так, инкубационный период сифилиса в среднем составляет 3-5 недель. Было замечено, что у асоциальных лиц, злоупотребляющих спиртным, а также у лиц с туберкулёзом и ВИЧ-инфекцией инкубационный период отличается от средних показателей в сторону уменьшения (2 недели).

Инкубационный период увеличивается на фоне приёма различных антибактериальных препаратов (до 6 месяцев).

На протяжении этого времени концентрация антител не успевает достигнуть диагностического титра. Однако, у инфицированного человека могут присутствовать клинические симптомы. Такой сифилис называется серонегативным.

Серопозитивным называют сифилис с яркой клинической картиной и присутствием в крови диагностического титра антитела (то есть положительный результат серологических реакций). При отсутствии лечения серопозитивный сифилис перетекает во вторичный сифилис, длящийся несколько лет.

8. Выявление T. pallidum в субстрате

8.1. Методика исследования Т. pallidum в «тёмном поле»

Популярным методом диагностики является обнаружение бледной трепонемы в тёмном поле микроскопа. Этот метод позволяет наблюдать за трепонемой, учитывать особенности её морфологии и движения.

Материал для исследования забирают с твердого шанкра или с эрозий гранулём и папул. Осторожно захватывают предварительно очищенный материал петлей, смешивают с каплей физиологического раствора и наносят на предметное стекло.

Живой материал изучают в тёмном поле микроскопа. Для этого применяют специальный конденсор, позволяющий изучать трепонему «во всей красе».

8.2. Микроскопия мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе

Для исследования фиксированных (сухих) мазков используется метод окрашивания по Романовскому-Гимзе. При таком окрашивании другие виды трепонем приобретают фиолетовый оттенок, а Т. pallidum - бледно-розовый цвет.

Остальные методы исследования, такие как способ Бури, серебрение по Морозову, простой фуксиновый метод и др., не получили широкого практического применения, ввиду малой информативности.

9. Серодиагностика

Выявление антител к бледной трепонеме проводится для:

1 Подтверждения клинического диагноза сифилиса;
2 Установления диагноза скрытого сифилиса;
3 Контроля за эффективностью проводимого лечения;
4 Подтверждения выздоровления больных сифилисом;
5 Профилактика сифилиса и диспансеризация населения (исследование крови определённых категорий людей, например, относящихся к группам риска).

Современные методы серодиагностики основаны на выявлении специфических и неспецифических антител разных классов.

9.1. Неспецифические серологические реакции

Лабораторное исследование крови проводится на предмет обнаружения противолипидных антител.

Реакция Вассермана (РВ, RW)

Является классической неспецифической реакцией. В её основе лежит принцип связывания комплемента. Проводится реакция с двумя-тремя антигенами. Исполняется как для количественного, так и для качественного определения неспецифических антител.

RW ставится с кардиолипиновым и трепонемным антигеном. Последний позволяет повысить специфичность реакции и оценить состояние иммунитета больного.

При первичном сифилисе RW имеет положительное значение в конце инкубационного периода, т.е. через примерно 4 недели от начала заболевания.

При исследовании больных вторичным сифилисом положительная RW выявляется у 100% больных и у 75% больных в стадии третичного сифилиса.

Нередко, RW даёт ложноположительные результаты. Они имеют место быть при следующих физиологических состояниях:

1 При других инфекциях, вызванных вирусами, бактериями, простейшими;
2 При злокачественных опухолевых процессах;
3 При коллагенозах;
4 При беременности на поздних сроках (после 30 недели) и после родов;
5 У здоровых лиц, употребляющих спиртные напитки, а также после приёма жирной пищи.

Реакции, основанные на агглютинации кардиолипина (MP - RPR, VDRL)

Эти реакции являются методом экспресс-диагностики сифилиса. По своему существу, это микрореакции, проводимые с плазмой крови (наиболее чувствительный метод) и инактивированной сывороткой (второй по чувствительности).

Они проводятся капельным способом и требуют использование специального антигена. Этот метод серодиагностики проводится для отбора положительных проб с дальнейшим исследованием лиц с помощью специфических реакций.

9.2. Специфическая серодиагностика

В основе диагностики представлены различные методы обнаружения специфических антител.

9.2.1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Занимает срединное положение из всех специфических методов серодиагностики. Реакция основана на принципах идентификации методом люминесцентной микроскопии флюоресцирующего комплекса, связанного с иммуноглобулином организма человека на поверхности клетки-патогена.

Флюоресцирующий комплекс состоит из человеческого глобулина и флюоресцеин тиоизоционата. Существует несколько модификаций этой реакции:

1 Реакция иммунофлюоресценции с адсорбцией;
2 Реакция IgМ – РИФ с адсорбцией.

9.2.2. Реакция иммобилизации Treponema pallidum (РИБТ)

Реакция РИБТ основана на особенности заражённой сыворотки крови людей обездвиживать бледные трепонемы.

В общих чертах методику можно объяснить так: в кровь больного добавляют антиген, приготовленный из сифиломы кролика и комплемент.

Иммобилизирующие антитела - это поздние антитела. Своего максимума они достигают к концу первого года болезни. Этот метод не применяется при первичном серонегативном сифилисе, считается наиболее трудоёмким.

9.2.3. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)

Данный метод диагностики автоматизирован. По чувствительности и специфичности сходен с реакцией иммунофлюоресценции с адсорбцией.

9.2.4. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

На фоне других серологических исследований, РНГА отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, особенно при использовании высококачественного антигена.

Принцип реакции основан на агглютинации эритроцитов, несущих на своей поверхности антигены бледной трепонемы, если к ним добавить специфические антитела. Результат РПГА будет положительным уже в конце инкубационного периода, т. е. через 3-4 недели.

Учитывая все особенности возбудителя сифилиса, можно выделить мероприятия, направленные на защиту здорового человека от заражения сифилисом.

Так как заболевание передаётся половым и контактным (бытовой сифилис) путями, стоит знать, что эффективными способами защиты являются барьерная контрацепция и соблюдение общих правил гигиены.