Подсчет тромбоцитов в мазке под микроскопом. Подсчет тромбоцитов по фонио. Методы нормализации показателей

Существуют различные методики подсчёта:

• В камере Горяева.
• По Фонио.
• При помощи люминесцентной микроскопии.
• С применением электронно-автоматических счётчиков.

Подсчёт обычно производится по методу швейцарского хирурга начала 20 века А.Фонио.

Метод Фонио

Подсчёт тромбоцитов по Фонио ― это самый распространённый метод.

Преимущество которого заключается в том, что тромбоциты учитываются не в жидком объёме, а в окрашенном мазке:

• клеточные элементы хорошо видны;
• исследовать материал можно в любое время, а не сразу после получения биологического материала;
• облегчается их «привязкой» к одной тысяче эритроцитов в 1 мл крови.

Кожу пациента протирают досуха.

Возможны два варианта действий лаборанта:

1. На место взятия анализа наносится небольшая капля 14% магнезии для предупреждения свёртывания крови. Полученную каплю крови смешивают с раствором и распределяют по предметному стеклу. Мазок сушат и окрашивают.
2. В пробирку вносят 25 мкл 14% магнезии или 6% ЭДТА и полный стеклянный капилляр крови, полученной из пальца, смешивают инвитро и готовят мазок. Время его высушивания зависит от реактива (2-3 часа при магнезии, 45 минут при ЭДТА). Затем окрашивают.

При исследовании мазка применяют окуляры с полем зрения, разделённым на квадраты, что облегчает подсчёт клеточных элементов.

В каждом квадрате считают эритроциты и тромбоциты. Подсчёт ведётся до обнаружения ровно одной тысячи эритроцитов.

Число тромбоцитов составляет абсолютную величину в промилле по отношению к эритроцитам (‰).

Зная общие цифры эритроцитов в 1 мкл крови, нужно умножить его на результат промилле для определения содержания в 1 мкл крови тромбоцитов:

Т = , где Т ― количество тромбоцитов, Э ― число эритроцитов в 1 мкл.

Исследование по Фонио может иметь погрешности, связанные с плохим качеством мазка и неравномерным распределением по стеклу тромбоцитов.

Подсчёт в камере Горяева является более точным, его погрешность всего 6,5%, но он более трудоёмкий и должен проводиться немедленно после взятия крови.

Для проведения метода кровь разводят реактивом для лизиса эритроцитов в 200 раз, вносят пипеткой в сетки камеры, настраивают фазово-контрастное устройство и под микроскопом считают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Для нахождения числа тромбоцитов в 1 мкл крови полученные цифры перемножают на 2000.

Коррекция уровня тромбоцитов

При несоответствии числа тромбоцитов по Фонио норме нужна помощь врача.

Повысить уровень тромбоцитов можно при помощи некоторых кортикостероидов, витаминов, препаратов-коагулянтов Дицинон, Этамзилат, Викасол, Револейт, Содекор.

Для укрепления сосудистой стенки полезна аскорбиновая кислота. В рационе должны быть мясо, морепродукты, гранаты, тыква, шиповник, свёкла, зелень.

Для снижения уровня тромбоцитов назначают препараты магния. В диете должны присутствоватьтакие продукты как лук, чеснок, рыбий жир, оливковое и льняное масло, томатный сок, яблочный уксус, зелёный чай.

Правильный сбалансированный рацион ― залог здорового равновесия свёртывающей системы крови.

Существуют следующие методы определения количества тромбоцитов в единице объема крови:

1) методика Фонио;

2) подсчет в камере Бюркера с сеткой Горяева;

3) использование фазоконтрастной и люминисцентной микроскопии;

4) электронно-автоматический метод (счетчики «Культер», «Целлоскоп»).

Для подсчета тромбоцитов периферической крови ча­ще всего применяют методику Фонио.

Оборудование и реактивы:

1) 14% раствор магния сульфата.

Ход исследования: для предупреждения склеивания тромбоцитов предварительно на место укола пальца нано­сят каплю 0,14 % раствора магния сульфата и через нее де­лают прокол. Выступившую каплю крови смешивают с каплей магния сульфата и делают мазок, который окра­шивают по Романовскому-Гимзе. Затем в мазке под мик­роскопом с иммерсионной системой одновременно подсчи­тывают 1000 эритроцитов и находящиеся среди них тром­боциты. Последние встречаются в препарате либо в оди­ночку, либо чаще разбросаны кучками между эритроцита­ми. По величине тромбоцит занимает приблизительно 1/3-1/4 эритроцита. Тромбоциты не имеют ядра и их ци­топлазма окрашена в синеватый цвет с красноватым от­тенком в центре. Зная содержание эритроцитов в 1 л кро­ви, легко вычисляют абсолютное количество тромбоцитов.

Нормальное количество тромбоцитов в периферической крови: 180.0 – 320.0 х 10 9 /л. (150-450 х 10 9 /л согласно рекомендациям ВОЗ).

Интерпретация полученных данных.

Причины увеличения числа тромбоцитов (тромбоцитоза).

Миелопролиферативные заболевания - хронический миелолейкоз, эритремия, эссенциальная тромбоцитемия.

Воспалительные процессы – острая ревматическая лихорадка, ревматоидный артрит и др.

Злокачественные опухоли - лимфогранулематоз, рак.

Острая кровопотеря и гемолитические анемии.

Спленэктомия.

Причины уменьшения количества тромбоцитов (тромбоцитопении).

Врожденные (синдром Вискотта-Олдрича и др.) и приобретенные (идиопатическая иммунная тромбоцитопеническая пурпура, СКВ и др.), иммунодефициты.

Апластическая, витамин-В 12 -фолиеводефицитная, тяжелая железодефицитная анемии.

ДВС-синдром, гемангиомы.

Вирусные инфекции, риккетсиозы, малярия.

Гиперспленизм.

«Синие» врожденные пороки сердца, застойная сердечная недостаточность.

Лучевая болезнь.

Лекарственные воздействия (цитостатики).

6. Методика сбора мокроты.

Мокротой называется патологический секрет, выделяемый с кашлем из дыхательных путей. Мокрота собирается в чистую широкогорлую стеклянную посуду с закручивающейся крышкой в утренние часы при кашле, после тщательного полоскания рта и горла, до приема пищи. Собирать мокроту за сутки и больше нецелесообразно, так как длительное стояние ведет к размножению флоры и аутолизу клеточных элементов. При необходимости мокроту сохраняют в прохладном месте (в холодильнике).

Источником наиболее ценной информации является содержимое трахеобронхиального дерева, полученное при бронхоскопии (промывные воды бронхов).

7. Исследование мокроты: макроскопическое, микроскопическое, бактериоскопическое. Понятие о бактериологическом методе исследования мокроты.

При макроскопическом изучении обращают внимание на: характер мокроты, количество, цвет, запах, консистенцию, слоистость, наличие различные включений.

Характер мокроты определяется ее составом.

Слизистая – состоит из слизи (продукта слизистых желез дыхательных путей). Выделяется при острых бронхитах, разрешении приступа бронхиальной астмы.

Слизисто-гнойная – представляет смесь слизи и гноя, причем слизь преобладает, а гной включен в виде комочков или прожилок. Наблюдается при хронических бронхитах, бронхопневмонии.

Гнойно-слизистая – содержит слизь и гной (преобладание гноя, слизь имеет вид тяжей). Характерна для хронических бронхитов, бронхоэктазии, абсцедирующей пневмонии.

Гнойная – не имеет примеси слизи и появляется в случае открытого в бронх абсцесса легкого, при прорыве эмпиемы плевры в бронх.

Слизисто-кровянистая – состоит из слизи с прожилками крови или кровяного пигмента. Отмечается при катарах верхних дыхательных путей, бронхогенном раке, пневмонии.

Слизисто-гнойно-кровянистая – содержит слизь, гной и кровь, чаще равномерно перемешанные между собой. Появляется при бронхоэктазах, туберкулезе, актиномикозе легких, бронхогенном раке.

Кровавое отделяемое (кровохаркание) – встречается при туберкулезе, опухолях бронхов и легкого, ранении легкого, актиномикозе.

Серозное отделяемое – характерно для отека легких, представляет собой пропотевшую в полость бронхов плазму крови.

Количество мокроты (величина отдельных порций и суточные количества) зависят от характера заболевания и от способности больного к отхаркиванию.

Скудное количество мокроты – характерно для воспаления дыхательных путей (трахеит, острый бронхит в начальной стадии, бронхиальная астма, бронхопневмония).

Обильное количество мокроты (от 0.5 до 2 л) выделяется обычно из полостей легочной ткани, бронхов (бронхоэктатическая болезнь, абсцесс легкого, прорыв эмпиемы), при повышенном кровенаполнении легких и пропотевании в легкие и бронхи большого количества плазмы крови (отек легких).

Цвет и прозрачность мокроты зависят от ее характера и от состава вдыхаемых частиц.

Слизистая мокрота – стекловидная, прозрачная; слизисто-гнойная – стекловидная с желтым оттенком; гнойно-слизистая – желто-зеленоватая; гнойная – желто-зеленая; слизисто-кровянистая – стекловидная с кровянистым или ржавым оттенком; слизисто-гнойно-кровянистая – стекловидная с желтыми комочками, прожилками красного цвета или ржавыми оттенками; отделяемое при легочном кровотечении – жидкое, красного цвета, пенистое; при распаде опухоли легкого может наблюдаться мокрота в виде «малинового желе»; отделяемое при отеке легких – жидкое, прозрачно-желтое с опалесценцией, пенистое и клейкое.

Мокрота с инородными примесями имеет цвет этих примесей: белая у мукомолов, черная у шахтеров и др.

Запах у мокроты появляется при длительном стоянии, а также при задержке мокроты в бронхах или полостях в легком и обусловлен деятельностью бактерий, вызывающих гнилостный распад белков. Свежевыделенная мокрота обычно не имеет запаха. Мокрота имеет неприятный запах при бронхоэктатической болезни, абсцессе легкого, туберкулезе, злокачественных новообразованиях с некрозом; зловонный (гнилостный) запах отмечается при гангрене легкого.

Консистенция тесно связана с характером мокроты и может быть вязкой, густой и жидкой. Вязкость зависит от содержания слизи и от количества форменных элементов - лейкоцитов, эпителия. Наиболее вязкая мокрота обнаруживается при муковисцидозе и бронхиальной астме.

Слоистость мокроты. При бронхоэктазах, гнилостном бронхите, абсцессе и гангрене легкого мокрота при стоянии разделяется на три слоя: на дне посуды находятся тяжелые элементы мокроты – гной и детрит, образующийся вследствие распада легочной ткани; средний слой составляет серозная жидкость; в верхнем – плавающие частицы, содержащие воздух и слизь.

В мокроте можно выявить:

1) спирали Куршмана – штопорообразно извитые трубчатые тела, имеющие диагностическое значение при бронхиальной астме;

2) фибринозные свертки – древовидно разветвленные образования эластичной консистенции, имеющие значение при фибринозном бронхите, реже - при крупозной пневмонии;

3) рисовидные тельца (линзы Коха) – плотные образования творожистой консистенции, состоящие из детрита, туберкулезных палочек и эластических волокон; обнаруживаются при кавернозном туберкулезе легких;

4) гнойные пробки Дитриха – состоят из детрита, бактерий, кристаллов жирных кислот, встречаются при гангрене легкого;

5) дифтеритические пленки;

6) некротизированные кусочки легкого;

7) частицы опухоли легкого;

8) друзы актиномицетов;

9) элементы эхинококка;

10) случайно попавшие из полости инородные тела (семена подсолнечника и др.).

Микроскопическое исследование мокроты.

Микроскопическое исследование мокроты проводят в свежих неокрашенных и фиксированных окрашенных препаратах.

Элементы мокроты, которые обнаруживаются в нативном препарате, можно разделить на три основные группы.

Клеточные элементы – плоский эпителий (одиночные клетки встречаются всегда, множественные – при воспалительных явлениях в ротовой полости); цилиндрический эпителий (встречается при остром катаре верхних дыхательных путей, остром бронхите, бронхиальной астме); макрофаги «жировые шары» (встречаются при раке легкого, туберкулезе, актиномикозе), сидерофаги – «клетки сердечных пороков», макрофаги с гемосидерином (обнаруживают при застое в малом круге кровообращения, при инфаркте легкого), кониофаги – пылевые макрофаги (характерны для пневмокониозов и пылевых бронхитов); опухолевые клетки; лейкоциты (в слизистой мокроте – единичные, в гнойной – покрывают все поля зрения); эритроциты (единичные могут быть в любой мокроте, окрашенной кровью).

Волокнистые образования – эластические волокна, которые указывают на распад легочной ткани при туберкулезе, абсцессе, опухоли, коралловые волокна (отложение на эластичном волокне жирных кислот и мыл) и обызвествленные волокна (пропитанные солями извести); фибринозные волокна (при фибринозном бронхите, крупозной пневмонии, иногда при актиномикозе); спирали Куршмана.

Кристаллические образования – кристаллы Шарко-Лейдена (продукт кристаллизации белков распавшихся эозинофилов, встречается при бронхиальной астме, глистных поражений легких), кристаллы гематоидина (обнаруживаются при кровоизлияниях в легочную ткань, в некротизированной ткани), кристаллы холестерина (встречаются при задержке мокроты в полостях – туберкулез, абсцесс, эхинококкоз); кристаллы жирных кислот – также образуются при застое мокроты в полостях легкого.

Окраску препаратов производят с целью изучения клеток крови в мокроте и для бактериологического исследования.

Для изучения клеток крови в мокроте применяют способ окрашивания по Романовскому-Гимзе. При этом способе окраски удается дифференцировать клетки лейкоцитарного ряда, эритроциты, однако, наибольшее значение имеет выделение эозинофилов (эозинофилия мокроты свойственна для бронхиальной астмы, глистного поражения легких, эозинофильной пневмонии).

Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской по Грамму имеет ориентировочное значение для выявления грамм-положительной и грамм- отрицательной микрофлоры. Окраска по Цилю-Нильсену производится с целью обнаружения микобактерий туберкулеза.

В случае, когда при бактериоскопии из-за малого количества микобактерий туберкулеза обнаружить из не удается, прибегают к ряду дополнительных исследований (люминесцентная микроскопия, методы накопления бактерий – флотация и электрофорез).

Иногда в окрашенном препарате можно выявить различные виды грибов – аспергиллы, кандиды, актиномицеты.

Бактериологическое исследование мокроты.

Бактериологический метод позволяет выделить возбудителя заболевания в чистом виде при посеве мокроты на питательные среды, определить вирулентность и лекарственную устойчивость (чувствительность) выделенного микроорганизма, что необходимо для рационального подбора антибактериальных средств. В некоторых случаях производят заражение экспериментальных животных мокротой, полученной от больного человека.

Существует три метода определения количества тромбоцитов:

1) Подсчет тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.е. с фазовоконтрастной приставкой. Коэффициент вариации 25-30%

2) Подсчет тромбоцитов в мазке крови (по Фонио), Коэффициент вариации 10-15%. Достоинство – возможность оценить морфологические особенности тромбоцитов.

3) Определение количества тромбоцитов на гематологическом анализаторе,

коэффициент вариации 4-10%.

Метод подсчета тромбоцитов в счетной камере Горяева микроскопией при фазовом контрасте, т.е. с фазовоконтрастной приставкой.

Принцип. Производится подсчет тромбоцитов в камере Горяева с применением в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости раствора оксалата аммония. При подсчете используют фазовоконтрастную микроскопию.

Реактивы: 1 % раствор оксалата аммония.

Ход определения. Исследование можно проводить как в крови, полученной из пальца, так и в стабилизированной цитратом венозной крови. В последнем случае полученный при подсчете результат умножают на коэффициент 1,1 (учитывают разведение венозной крови раствором цитрата натрия – 9:1). Самым удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках (не в меланжере). Для этого, в предварительно высушенную чистую силиконированную или пластиковую (полистирол) пробирку пипеткой отмеривают 1,98 мл 1% оксалата аммония и осторожно вносят в нее 0,02 мл крови. В течение 1-2 мин содержимое пробирки тщательно перемешивают без вспенивания. Заполняют две камеры Горяева и на 10-15 мин помещают их для оседания тромбоцитов во влажную камеру (чашку Петри со смоченной фильтровальной бумагой или марлей). В каждой камере подсчитывают тромбоциты в 25 больших квадратах.

Фазовоконтрастная микроскопия проводится при помощи обычного микроскопа, осветителя типа ОИ-19 (или аналогичного) и устройства для наблюдения методом фазового контраста КФ-1 или КФ-4 .

Метод подсчета тромбоцитов в мазках крови (по Фонио)

Принцип. Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактивы: Применяют 6% раствор этилендиаминтриацетата натрия (ЭДТА).

Ход определения. Смешивают кровь с раствором ЭДТА, для этого взятый капилляром Панченкова реактив до метки «75» вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую до метки «0». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 30-45 минут (обычно окраска тромбоцитов занимает в 1,5 – 2 раза больше времени, чем окраска мазка для подсчета формулы крови). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая тромбоциты в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены изолировано). Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения считают количество эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов.

Расчет: Количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А0/00. Зная число эритроцитов в 1 мкл (в 1 л) крови, легко подсчитать количество тромбоцитов в 1 мкл крови (в 1 л).

Например. А=600/00 ; число эритроцитов 5 000000 в 1 мкл (5*106/мкл или 5*1012/л)

Составляют пропорцию:

Х – 5000000,откуда

Х= 60*5*1000000/1000=300*1000 мкл (300*103/мкл или 300*109/л).

Определение количества тромбоцитов с помощью гематологического анализатора

В настоящее время все шире используются определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью автоматических счетчиков крови, или гематологических анализаторов. Эти аппараты точны, и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).

Подсчет тромбоцитов проводят согласно инструкции к аппарату. Бюджетные модели гематологических анализаторов определяют только количество тромбоцитов, а более совершенные приборы содержат полный анализ тромбоцитарного звена, и позволяют говорить о морфологии тромбоцитов. Развернутый анализ тромбоцитов на анализаторе позволяет определить такие показатели:

РLТ – количество тромбоцитов.

Норма от 180-320109/л; При выходе за эти пределы необходима микроскопия мазка.

MPV – средний объем тромбоцитов. «Молодые» тромбоциты имеют больший объем. MPV увеличивается с возрастом. Норма: 8,6-8,9 фл у детей 1 – 5 лет; 9,5-10,6 фл у людей старше 70 лет.

PDV ширина распределения тромбоцитов по объему отражает степень анизоцитоза тромбоцитов. Норма = 14-18%.

РСТ – тромбокрит доля объема цельной крови, занимаемая тромбоцитами (аналогичен Hct). Норма = 0,15-0,40%.

Также гематологический анализатор строит график распределения тромбоцитов по размеру .

Принцип . Подсчет количества тромбоцитов на 1000 эритроцитов в окрашенных мазках крови и перерасчет их числа на 1 мкл или 1 л, в соответствии с количеством эритроцитов в этом объеме крови.

Реактивы : 1) 14% раствор сульфата магния; 2) 2,6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

Ход определения . В пробирку вносят реактив 1 или 2, взятый капилляром Панченкова до отметки «75», затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром до отметки «К (0)». Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе (см. «Окраска мазков крови ») в течение 2–3 ч (при использовании реактива 1) или 35–45 мин (при использовании реактива 2).

Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая тромбоциты в тонких местах препарата (эритроциты должны располагаться изолированно друг от друга). Тромбоциты окрашиваются в розовато-фиолетовый цвет, имеют округлую форму, размер 2–4 мкм, в центре клетки отчетливо определяется зернистость - грануломер, периферическая часть имеет более светлую окраску, незернистая - гиаломер.

Подсчет производят следующим образом. В каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Для удобства и большей точности счета рекомендуется пользоваться окуляром с уменьшенным полем зрения. При его отсутствии можно уменьшить поле зрения приемом, описанным в «Подсчет ретикулоцитов ». Параллельно берут кровь для подсчета числа эритроцитов в камере Горяева.

Расчет . Зная количество эритроцитов в 1 мкл (или 1 л) крови и количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов, легко рассчитать и содержание тромбоцитов в крови.

Норма у здорового человека:

Подсчитывание числа тромбоцитов по Фонио

Исследование по методике Фонио применяется наиболее часто. Оно базируется на определении количества пластинок в окрашенных мазках крови с использованием химреактивов:

• сульфат магния 14%;
• этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) натрия 6%.

Подсчет тромбоцитов в мазке крови

Ход исследования

Сульфат магния или ЭДТА при помощи капилляра Панченкова помещают в стеклянную пробирку, туда же помещают капиллярную кровь, которую берут, используя тот же капилляр.

Кровь с реактивом перемешивают, а затем из полученного раствора готовят материал для определения.

Для этого на предметное стекло наносятся тонкие мазки, они фиксируются и окрашиваются:

• с применением магния сульфата – 2-3 часа;
• с использованием ЭДТА – 30-45 минут.

После высыхания мазки разглядывают под микроскопом, у которого имеется иммерсионный объектив для увеличения изображения и усиления яркости.

Кровяные пластинки должны располагаться по отдельности, чтобы этого добиться используется самое тонкое место мазка.

Как считать тромбоциты в мазке крови?

Для подсчета мазок передвигается под объективом микроскопа, чтобы были подсчитаны 1000 эритроцитов. Затем считают находящиеся среди них кровяные пластинки.

При известном количестве эритроцитов в одном литре крови, можно произвести подсчет абсолютного числа тромбоцитов.

Определение количества при помощи камеры Горяева

По методу Горяева тромбоцитарные пластинки считает камера с применением цитратного вещества. Число клеток определяют в 1 МК/л или в литре крови.

Для этого используют следующие химреактивы:

Химреактив №1:

• гидрохлорид кокаина 3 г;
• хлорид натрия 0,25 г;
• фурацилин 0,25 г;
• вода 100 мл.

Химреактив №2:

• 1% раствор оксалата аммония. Раствор надо прокипятить, профильтровать и после этого он хранится на холоде. При помощи этого реактива растворение эритроцитов происходит быстрее.

Ход исследования

Используют материал, взятый из вены в пробирку с цитратом. Этим веществом служит ЭДТА. При взятии из пальца тромбоциты могут давать сгустки.

Нужно взять 4 мл химреактива №1 или №2, добавить 0,02 мл крови, получится разведение в 200 раз. Кровь с реактивом слегка взбалтывают, оставляют на полчаса, за это время происходит лизис.

В подготовленную камеру помещают материал из подготовленной крови, а затем опускают во влажную чашку Петри на 5 минут для оседания тромбоцитарных клеток.

В камере клетки хорошо видны, благодаря тому, что используется фазово-контрастные линзы объектива.

Частицы пыли и грязи должны быть хорошо вымыты, чтобы не оставлять след на стеклянной таре и самой камере, иначе их при подсчете можно принять за тромбоциты.

Подсчитывание с помощью счетчиков

Счетчик называется автоматический гематологический аппарат. С его помощью можно определить количество кровяных пластинок, также сделать гистограмму (распространение по величине).

Аппаратное исследование достаточно точное, делается экспресс-методом, который выдает результаты в течение 1 минуты.