Объекты генной инженерии. Генная инженерия человека

Введение

В своей работе я раскрываю тему генной инженерии. Возможности, открываемые генетической инженерией перед человечеством, как в области фундаментальной науки, так и во многих других областях, весьма велики и нередко даже революционны.

Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое производство нужных белков, значительно облегчает технологические процессы для получения продуктов ферментации - энзимов и аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека.

Таким образом, генная инженерия, будучи одними из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.

Но особенно большие возможности генная инженерия открывает перед медициной и фармацевтикой, поскольку применение генной инженерии может привести к коренным преобразованиям медицины.

1. Сущность генетической инженерии.

1.1. История генной инженерии.

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики.

На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу.

Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК.

С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально.

Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали кишечная палочка (E. Coli), ее вирусы и плазмиды.

Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов.

ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов.

В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа:

Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-реципиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг и С. Коэн с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

1.2. Понятие о генной инженерии

Одним из разделов молекулярной генетики и молекулярной биологии, который нашел наибольшее практическое приложение, является генная инженерия.

Генная инженерия – это сумма методов, позволяющих переносить гены из одного организма в другой, или – это технология направленного конструирования новых биологических объектов.

Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка.

Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин.

Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100г кристаллического инсулина требуется 800-1000кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200-250грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков.

Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин.

Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается.

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см.

Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.

Компания «Genentec» в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР.

1.3. Цели и задачи генной инженерии

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход «белок-ген», получивший название «обратная генетика». При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Таким способом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, передающие мутантный ген потомками.

Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

·специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

·быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

·конструирование рекомбинантной ДНК;

·гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью;

·клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

·введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

2.1. Выделение генов, содержащих необходимую информацию.

Получение генов возможно несколькими путями: выделением из ДНК, химико-ферментным синтезом и ферментным синтезом.

Выделение генов из ДНК проводят с помощью рестриктаз, катализирующих расщепление ДНК на участках, имеющих определенные нуклеотидные последовательности (4–7 нуклеотидных пар). Расщепление можно проводить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар; при этом обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты ДНК имеют так называемые «тупые» концы. Возможно расщепление ДНК со сдвигом, при этом одна из нитей выступает на несколько нуклеотидов. Образуемые при этом «липкие» концы в силу своей комплементарности вступают во взаимодействие. Нуклеотидную последовательность с липкими концами можно присоединить к вектору (предварительно обработанному той же рестриктазой), Превратить в кольцевую в результате сшивания лигазами взаимно комплиментарных концов. Метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать действие ферментов для строгого вычленения нужного гена. Вместе с геном захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.

Химико-ферментный синтез применяют в том случае, если известна первичная структура белка или пептида, синтез которого кодирует ген. Необходимо полное знание нуклеотидной последовательности гена. Этот метод позволяет точно воссоздать нужную последовательность нуклеотидов, а также вводить в гены участки узнавания рестриктаз, регуляторных последовательностей и пр. Метод состоит из химического синтеза одно цепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами, обычно 8–16-звенных. В настоящее время существуют «генные машины», которые под контролем микропроцессора очень быстро синтезируют специфические короткие последовательности одноцепочечной ДНК

Нужная последовательность оснований вводится на клавишный пульт управления. Микропроцессор открывает клапаны, через которые с помощью насоса в синтезирующую колонку последовательно поступают нукеотиды, а также необходимые реагенты и растворители. Колонка наполена бусинками кремния, на которых собираются молекулы ДНК. В данном устройстве возможен синтез цепей длиной до 40 нуклеотидов со скростью 1 нуклеотид за 30 минут. Полученные олигонуклеотиды с помощью ДНК-лигазы сшиваются между собой с образованием двуцепочечного нуклеотида. С помощью данного метода были получены гены А- и В-цепей инсулина, проинсулина, соматостатина и др.

Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК(мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом. Сначала из клеток выделяют матричные РНК, среди которых присуттвует мРНК, кодируемая геном, который требуется выделить. Затем в одобранных условиях на выделенной из клетки мРНК, как на матрице, с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется нить ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использованием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК образуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.

Метод с большим успехом применен для получения в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина). Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена. Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществляется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

2.2. Подбор векторов (вирусы, плазмиды), способных к самостоятельной репликации в клетке реципиента.

Под понятием «вектор» понимается молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции.

Векторные молекулы должны обладать следующими свойствами:

1) способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном;

В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток.

В качестве прокариотических векторов используются плазмиды, бактериофаги; в качестве эукариотических векторов применяют вирусы животных и растений, векторы на основе 2 мкм дрожжей и митохондрий и ряд искусственно сконструированных векторов, способных реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).

Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках. Большинство плазмидных векторов получено на основе природных плазмид ColE1, pMB1 и p15A.

Бактериальные плазмиды делят на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на базе плазмид второго класса. Многие природные плазмиды уже содержат гены, определяющие устойчивость клеток к антибиотикам (продукты этих генов - ферменты, модифицирующие или расщепляющие антибиотические вещества). Кроме того, в эти плазмиды при конструировании векторов вводятся дополнительные гены, определяющие устойчивость к другим антибиотикам.

На рис. 1 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli - pBR322. Он сконструирован на базе детально изученной плазмиды E.coli - колициногенного фактора ColE1 - и содержит ориджин репликации этой плазмиды. Особенность плазмиды ColE1 (и pBR322 соответственно) состоит в том, что в присутствии ингибитора синтеза белка антибиотика хлорамфеникола (опосредованно ингибирующего репликацию хозяйской хромосомы) ее число в E.coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большие количества клонируемого гена. При конструировании вектора pBR322 из исходных плазмид был делегирован целый ряд «лишних» сайтов для рестриктаз.

В настоящее время наряду с множеством удобных векторных систем для E.coli сконструированы плазмидные векторы для ряда других грамотрицательных бактерий (в том числе таких промышленно важных, как Pseudomonas, Rhizobium и Azotobacter), грамположительных бактерий (Bacillus), низших грибов (дрожжи) и растений.

Плазмидные векторы удобны для клонирования относительно небольших фрагментов (до 10 тыс. пар оснований) геномов небольших размеров. Если же требуется получить клонотеку (или библиотеку) генов высших растений и животных, общая длина генома которых достигает огромных размеров, то обычные плазмидные векторы для этих целей непригодны. Проблему создания библиотек генов для высших эукариот удалось решить с использованием в качестве клонирующих векторов производных бактериофага l.

Среди фаговых векторов наиболее удобные системы были созданы на базе геномов бактериофагов l и М13 E.coli. ДНК этих фагов содержит протяженные области, которые можно делегировать или заменить на чужеродную ДНК, не затрагивая их способности реплицироваться в клетках E.coli. При конструировании семейства векторов на базе ДНК l фага из нее сначала (путем делений коротких участков ДНК) были удалены многие сайты рестрикции из области, не существенной для репликации ДНК, и оставлены такие сайты в области, предназначенной для встраивания чужеродной ДНК. В эту же область часто встраивают маркерные гены, позволяющие отличить рекомбинантную ДНК от исходного вектора. Такие векторы широко используются для получения «библиотек генов». Размеры замещаемого фрагмента фаговой ДНК и соответственно встраиваемого участка чужеродной ДНК ограничены 15-17 тыс. нуклеотидных остатков, так как рекомбинантный фаго - вый геном, который на 10% больше или на 75% меньше генома дикого l фага, уже не может быть упакован в фаговые частицы.

Рисунок 1. Детальная рестрикционная карта плазмиды pBR322.

Таких ограничений теоретически не существует для векторов, сконструированных на базе нитчатого бактериофага М13. Описаны случаи, когда в геном этого фага была встроена чужеродная ДНК длиной около 40 тыс. нуклеотидных остатков. Известно, однако, что фаг М13 становится нестабильным, когда длина чужеродной ДНК превышает 5 тыс. нуклеотидных остатков. Фактически же векторы, полученные из ДНК фага М13, используются главным образом для секвенирования и мутагенеза генов, и размеры встраиваемых в них фрагментов намного меньше.

Эти векторы конструируются из реплекативной (двутяжевой) формы ДНК фага М13, в которую встроены «полилинкерные» участки (пример такой конструкции показан на рис. 5). В фаговую частицу ДНК включается в виде однотяжевой молекулы. Таким образом, этот вектор позволяет получать клонированный ген или его фрагмент как в двутяжевой, так и в однотяжевой форме. Однотяжевые формы рекомбинантных ДНК широко используются в настоящее время при определении нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера и для олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенеза генов.

Перенос чужеродных генов в клетки животных осуществляется с помощью векторов, полученных из ДНК ряда хорошо изученных вирусов животных - SV40, некоторых аденовирусов, вируса папиломы быка, вируса оспы и так далее. Конструирование этих векторов проводится по стандартной схеме: удаление «лишних» сайтов для рестриктаз, введение маркерных генов в области ДНК, не существенные для ее репликации (например, гена тимидин-киназы (tk) из HSV (вируса герпеса)), введение регуляторных районов, повышающих уровень экспрессии генов.

Удобными оказались так называемые «челночные векторы», способные реплицироваться как в клетках животных, так и в клетках бактерий. Их получают, сшивая друг с другом большие сегменты векторов животных и бактерий (например, SV40 и pBR322) так, чтобы районы, ответственные за репликацию ДНК, остались незатронутыми. Это позволяет проводить основные операции по конструированию вектора в бактериальной клетке (что технически намного проще), а затем полученную рекомбинантную ДНК использовать для клонирования генов в животной клетке.

Рисунок 2. Рестрикционная карта вектора М13 mp8.

2.3. Получение рекомбинантной ДНК.

Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключается во встраивании фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК, в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы) - плазмидные или вирусные ДНК, которые могут быть перенесены в клетки про- или эукариот и там автономно репли-цироваться. На следующем этапе проводится отбор тех клеток, которые несут в себе рекомбинантные ДНК (с помощью маркерных признаков, которыми обладает сам вектор), и затем индивидуальных клонов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы, специфичные для данного гена или участка ДНК).

При решении ряда научных и биотехнологических задач конструирование рекомбинантных ДНК требует также создания систем, в которых обеспечивается максимальная экспрессия клонируемого гена.

Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторные молекулы. В первом случае 3"-концы фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью (например, поли (Т)). 3"-концы линейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комплементарной ей гомополинуклеотидной последовательностью (то есть поли (А)). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплементарного спаривания искусственно полученных «липких» концов.

Во втором случае «липкие» концы создаются с помощью расщепления молекул ДНК (как векторной, так и содержащей интересующий нас фрагмент) одной из эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы характеризуются исключительно высокой специфичностью. Они «узнают» в ДНК последовательность из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них строго определенные межнуклеотидные связи. Поэтому даже в ДНК больших размеров рестриктазы вносят ограниченное число разрывов.

Третий способ представляет собой комбинацию двух первых, когда липкие концы ДНК, образованные рестриктазой, удлиняются синтетическими последовательностями (рис. 3).

Концы фрагментов ДНК можно превратить в «липкие», наращивая их двутяжевыми олигонуклеотидами («линкерами»), в состав которых входит участок узнавания рестрикта-

Рисунок 3. Схема конструирования рекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз PstI и поли(G)- поли(С)-линкера.

зой. Обработка такого фрагмента данной рестриктазой делает его пригодным для встраивания в векторную молекулу ДНК, расщепленную той же рестриктаэой. Часто в качестве «линкера» применяются полинуклеотидные фрагменты, которые содержат специфические участки сразу для нескольких рестриктаз (их называют «полилинкерами»).

После встраивания чужеродной ДНК в вектор их ковалентное сшивание осуществляется ДНК-лигазой. Если же размер бреши в рекомбинированной молекуле превышает одну фосфодиэфирную связь, она застраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарирующих систем клетки.

2.4. Введение рекомбинантной ДНК в клетку – реципиент

Перенос рекомбинантных ДНК осуществляется путем трансформации или конъюгации. Трансформация – это процесс изменения генетических свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК. Впервые она была обнаружена у пневмококков Ф. Гиффитом, который показал, что некоторые клетки невирулентных штаммов бактерий при заражении ими мышей совместно с вирулентными штаммами приобретают патогенные свойства. В дальнейшем трансформация была продемонстрирована и изучена у различных видов бактерий. Установлено, что к трансформации способны лишь некоторые, так называемые «компетентные», клетки (способные включать чужеродную ДНК и синтезирующие особый трансформирующий белок). Компетентность клетки определяется также факторами внешней среды. Этому может способствовать обработка клеток полиэтиленгликолем или хлоридом кальция. После проникновения в клетку одна из нитей рекомбиантной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком реципиентной ДНК может включиться в хромосому или внехромосомную единицу. Трансформация является наиболее универсальным способом передачи генетической информации и имеет наибольшее значение для генетических технологий.

Конъюгация – один из способов обмена генетического материала, при котором происходит однонаправленный перенос генетической информации от донора к реципиенту. Этот перенос находится под контролем особых конъюгативных плазмид (фактор фертильности). Перенос информации от донорской клетки в реципиентную осуществляется через специальные половые ворсинки (пили). Возможна передача информации и с помощью неконъюгативных плазмид при участии плазмид-помощниц.Передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию в клетке фаговых частиц, называется трансфекцией. Методика применительно к бактериальным клеткам включает получение сферопластов, очистку инкубационной среды от нуклеаз и добавление очищенной фаговой ДНК (присутствие протаминсульфата повышает эффективность трансфекции). Методика применима к животным и растительным клеткам с участием специальных челночных вирусных векторов.

В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генно-инженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генно-инженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генно-инженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генно-инженерных вирусных векторов для исцеления взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) - игрунка обыкновенная.

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия/ Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем.

Заключение

В результате интенсивного развития методов генетической инженерии получены клоны множества генов рибосомальной, транспортной и 5S РНК, гистонов, глобина мыши, кролика, человека, коллагена, овальбумина, инсулина человека и др. пептидных гормонов, интерферона человека и прочее.

Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности.

На основе генетической инженерии возникла отрасль фармацевтической промышленности, названная «индустрией ДНК». Это одна из современных ветвей биотехнологии.

Для лечебного применения допущен инсулин человека (хумулин), полученный посредством рекДНК. Кроме того, на основе многочисленных мутантов по отдельным генам, получаемых при их изучении, созданы высокоэффективные тест-системы для выявления генетической активности факторов среды, в том числе для выявления канцерогенных соединений.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА:

1) Бекиш О.-Я.Л. Медицинская биология. – Мн.: Ураджай, 2000. – с.114-119.

2) Мутовин Г.Р. Основы клинической генетики. – М.: Высшая школа, 1997. – с. 83-84.

3) Заяц Р.С. Основы медицинской генетики. – Мн.: Высшая школа, 1998. – с. 60-65.

4) biotechnolog.ru

План:

Введение.

1.Сущность генетической инженерии.

1.1. История генной инженерии

1.2. Понятие о генной инженерии

1.3. Цели и задачи генной инженерии

2. Этапы создания организмов с генетически измененной программой.

2.1. Выделение генов (естественных или синтезированных), содержащих необходимую информацию.

2.2. Подбор векторов (вирусы, плазмиды), способных к самостоятельной репликации в клетке реципиента.

2.3. Получение рекомбинантной ДНК.

2.4. Введение рекомбинантной ДНК в клетку - реципиент.

3.Применение генно-инженерных технологий в медицине.

Сложно найти в современном мире человека, который ничего не слышал бы об успехах генной инженерии.

Сегодня она является одним из наиболее перспективных путей развития биотехнологий, совершенствования сельскохозяйственного производства, медицины и ряда других отраслей.

Что такое генная инженерия?

Как известно, наследственные признаки любого живого существа записаны в каждой клетке организма в виде совокупности генов – элементов сложных белковых молекул . Вводя в геном живого существа чужеродный ген, можно изменить свойства получаемого организма, причём в нужную сторону: сделать сельскохозяйственную культуру более устойчивой к морозу и болезням, придать растению новые свойства и т.д.

Организмы, полученные в результате такой переделки, называются генно-модифицированными, или трансгенными, а научная дисциплина, занимающаяся исследованием модификаций и разработкой трансгенных технологий – генетической или генной инженерией.

Объекты генной инженерии

Наиболее часто объектами для исследования генной инженерии становятся микроорганизмы, клетки растений и низших животных, однако ведутся исследования и на клетках млекопитающих, и даже на клетках человеческого организма. Как правило, непосредственным объектом исследования является молекула ДНК, очищенная от прочих клеточных веществ. При помощи энзимов ДНК расщепляется на отдельные отрезки, причём важно уметь распознавать и выделять нужный отрезок, переносить его при помощи энзимов и встраивать в структуру другой ДНК.

Современные методики уже позволяют достаточно свободно манипулировать отрезками генома, размножать нужный участок наследственной цепи и вставлять его на место другого нуклеотида в ДНК реципиента. Накоплен достаточно большой опыт и собрана немалая информация по закономерностям строения наследственных механизмов. Как правило, преобразованиям подвергаются сельскохозяйственные растения, что уже позволило существенно повысить результативность основных продовольственных культур.

Для чего нужна генная инженерия?

К середине ХХ века традиционные методы перестали устраивать учёных, так как это направление обладает рядом серьёзных ограничений:

невозможно скрещивать неродственные виды живых существ;
процесс рекомбинации генетических признаков остаётся неуправляемым, и необходимые качества у потомства появляются в результате случайных комбинаций, при этом очень большой процент потомства признаётся неудачным и отбрасывается в ходе селекции;
точно задать нужные качества при скрещивании невозможно;
селекционный процесс занимает годы и даже десятилетия.

Естественный механизм сохранения наследственных признаков является чрезвычайно стойким, и даже появление потомства с нужными качествами не даёт гарантии сохранения этих признаков в последующих поколениях.

Генная инженерия позволяет преодолеть все вышеперечисленные затруднения. С помощью трансгенных технологий можно создавать организмы с заданными свойствами, заменяя отдельные участки генома другими, взятыми у живых существ, принадлежащих к другим видам. При этом сроки создания новых организмов существенно сокращаются. Необязательно закреплять нужные признаки, делая их наследуемыми, так как всегда есть возможность генетически модифицировать следующие партии, поставив процесс буквально на поток.

Этапы создания трансгенного организма

Выделение изолированного гена с нужными свойствами. Сегодня для этого существуют достаточно надёжные технологии, есть даже специально подготовленные библиотеки генов.
Ввод гена в вектор для переноса. Для этого создаётся специальная конструкция – трансген, с одним или несколькими отрезками ДНК и регуляторными элементами, который встраивается в геном вектора и подвергается клонированию при помощи лигаз и рестриктаз. В качестве вектора обычно используются кольцеобразные бактериальные ДНК – плазмиды.
Встраивание вектора в организм реципиента. Этот процесс скопирован с аналогичного природного процесса встраивания ДНК вируса или бактерии в клетки носителя и действует таким же образом.
Молекулярное клонирование. При этом клетка, подвергшаяся модификации, успешно делится, производя множество новых дочерних клеток, которые содержат изменённый геном и синтезируют белковые молекулы с заданными свойствами.
Отбор ГМО. Последний этап ничем не отличается от обычной селекционной работы.

Безопасна ли генная инженерия?

Вопрос, насколько безопасны трансгенные технологии, периодически поднимается как в научной среде, так и в СМИ, далёких от науки. Однозначного ответа на него нет до сих пор.

Во-первых, генная инженерия остаётся ещё достаточно новым направлением биотехнологий, и статистика, позволяющая делать объективные выводы об этой проблеме, пока что не успела накопиться.

Во-вторых, огромные вложения в генную инженерию со стороны транснациональных корпораций, занимающихся производством продуктов питания, могут служить дополнительной причиной отсутствия серьёзных исследований.

Впрочем, в законодательствах многих стран появились нормы, обязывающие производителей указывать наличие продуктов из ГМО на упаковке товаров пищевой группы. В любом случае, генная инженерия уже продемонстрировала высокую результативность своих технологий, а её дальнейшее развитие обещает людям ещё больше успехов и достижений.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генноинженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для излечения взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) - игрунка обыкновенная.

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

_____________________________________________________________________________________________

Генетическая инжене́рия (генная инженерия)

Это совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии , используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.
Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

Генная инженерия - это область биотехнологий, включающая в себя действия по перестройке генотипов. Уже сегодня генная инженерия позволяет включать и выключать отдельные гены, контролируя таким образом деятельность организмов, а также - переносить генетические инструкции из одного организма в другой, в том числе – организмы другого вида. По мере того, как генетики всё больше узнают о работе генов и белков, всё более реальной становится возможность произвольным образом программировать генотип (прежде всего, человеческий), с лёгкостью достигая любых результатов: таких, как устойчивость к радиации, способность жить под водой, способность к регенерации повреждённых органов и даже бессмертие.

Генная инженерия – это направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств.

Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 год. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или ферменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.

Генная инженерия бактерий

В 1972 году группа исследователей во главе с американским биохимиком Полом Бергом, работавшим в Стэнфордском университете, что неподалёку от Сан-Франциско в Калифорнии, сообщила о создании вне организма первой рекомбинантной ДНК. Такую молекулу часто называют гибридной, так как она состоит из ДНК-фрагментов различных организмов.

Первая рекомбинантная молекула ДНК состоит из фрагмента ДНК бактериофага кишечной палочки (E. coli), группы генов самой этой бактерии, ответственные за сбраживание сахара галактозы, и полной ДНК вируса SV40, вызывающего развитие опухолей у обезьян. Такая рекомбинантная структура теоретически могла обладать функциональной активностью в клетках, как кишечной палочки, так и обезьяны, ведь в неё входила часть ДНК фага, обеспечивающая её способность реплицироваться (самокопироваться) в E. coli, и вся ДНК SV40, реплицирующаяся в клетках обезьяны.

Фактически это была первая гибридная молекула ДНК, которая могла бы, как челнок, «ходить» между бактерией и животным. Но именно это экспериментально не проверил П.Берг и его коллеги.

Учёные разных стран, развивая идеи П.Берга, создали in vitro функционально активные гибридные ДНК. Первыми эту задачу решили американцы Стэнли Коен из Стэнфордского университета и его коллега Герберт Бойер из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. В их работах появился новый и очень важный «инструмент» всех последующих генно-инженерных работ – вектор.

Основные методы генной инженерии бактерий были разработаны в начале 70-х годов прошлого века. Их суть заключается во введении в организм нового гена. Наиболее распространённый из них – конструирование и перенос рекомбинантных ДНК.

Генная инженерия растений

При введении новых генов в эукариотические клетки, например, растительные, возникает немало трудностей. Одна из них заключается в том, что генетическое строение растений намного сложнее и менее изучено, чем строение бактерий, остававшихся до недавнего времени основным объектом генных инженеров. К тому же изменить генотип всех клеток многоклеточного организма невозможно. Значительно затрудняется перенос векторных систем прочная целлюлозная оболочка, которая покрывает клетки растений.

Несмотря на сказанное генная инженерия растений применяется в сельском хозяйстве, особенно в растениеводстве. Это стало возможным, во-первых, потому, что изолированные от многоклеточного организма клетки растений могут расти и размножаться на искусственных питательных средах, то есть in vitro или вне организма. Во-вторых, установлено, что ядра зрелых растительных клеток содержат всю информацию, необходимую для кодирования целого организма. Так, если клетки какого-либо растения пометить в подходящий растительный раствор, то их можно вновь заставить делиться и образовывать новые растения. Это свойство растительных клеток, связанное со способностью к регенерации уже после достижения ими зрелости и специализации, названо тотипотентностью.

Использование почвенных агробактерий

Один их эффективных способов переноса генов в растения – использование в качестве вектора почвенных бактерий, прежде всего, Agro bacterium tumefaciens («полевая бактерия, вызывающая рак растений»). Эта бактерия была выделена в 1897г. из опухоли винограда. Она заражает многие двудольные растения и вызывает у них образование больших наростов – корончатых галлов.

Патогенные штаммы этой агробактерии в отличие от непатогенных содержат крупную плазмиду, специально предназначенную для переноса генов из бактериальной клетки в растительную. Плазмида получила название Ti, то есть вызывающая опухоль. Именно в неё обычно встраивается подготовленный для переноса ген.

Кроме A. tumefaciens для введения новых генов в растения используют также бактерию вида A. Rhizogenes. Они вызывают у двудольных растений очень мелкие опухоли, из которых вырастает множество корней. Болезнь, которую вызывают эти ризогенные агробактерии, называют «бородатый» или «волосатый» корень. В них обнаружены плазмиды, похожие на Ti. Они названы Ri или корнеиндуцирующими.

В последние годы Ri-плазмиды применяются в генной инженерии растений не менее широко, чем Ti-плазмиды. Это объясняется, прежде всего, тем, что клетки корончатых галлов плохо растут на искусственно питательных средах и из них не удаётся вырастить целые растения. Напротив, клетки «бородатого» корня хорошо культивируются и регенерируются.

Использование вирусов

Вирусы также достаточно часто используются для конструирования векторов, обеспечивающих перенос новых генов в растения. Чаще других для этой цели выделяют вирус мозаики цветной капусты. В природе он заражает только крестоцветные, однако известно, что в экспериментальных условиях способен поражать и другие виды растений.

Геном вируса мозаики представляет собой небольшую двунитевую кольцевую ДНК. Некоторые из его генов могут быть заменены на другие, интересующие исследователя. Проникая в растительную клетку, вирус вносит в неё не только свою собственную ДНК, но и встроенный в неё чужеродный ген.

Векторной системой, способной переносить новые гены в растения, могут быть и вирусы, у которых генетический материал представлен РНК. Вирусы этой группы способны с высокой частотой проникать в растительные клетки, активно в них размножаться и тем самым обеспечивать высокий уровень экспрессии введённых генов вследствие увеличения их количества.

Конструирование рекомбинантной ДНК

Техника встраивания генов в векторы предназначенных для растений аналогична той, что используется для бактериальных клеток. Плазмидная ДНК и ДНК вирусов разрезается рестриктазами с образованием «липких» концов. Если применяется фермент, образующий тупые концы, пользуются короткими фрагментами ДНК. Встраивая новый ген в подготовленный плазмидный или вирусный вектор с помощью ДНК-лигазы, получают рекомбинантную ДНК.

Направления генной инженерии растений

Основные направления генной инженерии растений связаны с созданием культур, устойчивых к насекомым-вредителям, гербицидам и вирусам, способных к азотфиксации, а также с повышением качества и количества продуктов.

Растения устойчивые к насекомым-вредителям

Насекомые-вредители могут приводить к значительному снижению урожая различных сельскохозяйственных культур. Для борьбы с ними используются химические вещества,

называемые инсектицидами. Первым инсектицидом, завоевавшим всемирное признание, оказалась бордосская жидкость.

Помимо препаратов, синтезированных химически, известны инсектициды, полученные на основе естественных врагов насекомых – бактерий и грибов. Многие годы в мире применяют инсектициды бактериального происхождения – препараты спор, которые образует почвенная бактерия Bacillus thuringiensis («тюрингская бацилла», или сокращённо Bt). Инсектицидная активность этих спор связана с находящимися в них ядовитыми кристаллами белка эндотоксина. Проглотив такую спору, гусеница вскоре погибает от паралича кишечника.

Преимущество инсектицидов этого типа в том, что они не токсичны для человека и животного, их легко отмыть и инактивировать. Недостаток таких инсектицидов – сравнительно короткий период активности в полевых условиях. Эффективность их действия при распылении на растения колеблется, и её трудно прогнозировать. Всё это обуславливает необходимость повторных обработок.

Новое направление в борьбе с насекомыми-вредителями – создание на основе генно-инженерной технологии устойчивых к ним трансгенных растений. Успешными оказались исследования Марка ван Монтегю и его коллег из Гентского университета, результаты которых они опубликовали в работе «Трансгенные растения, защищённые от нападения насекомых» (1987).

Они выделили ген, кодирующий синтез белка эндотоксина, из ДНК тюрингской бациллы и вставили его в векторную Ti-плазмиду бактерии A. tumefaciens. Этой агробактерией заражали диски, вырезанные из кусочков листьев табака. Трансформированную растительную ткань выращивали на питательной среде определённого химического состава, которая обеспечивала рост и развитие трасгенных растений с листьями, содержащими белок эндотоксин. При попадании в кишечник некоторых видов насекомых эндотоксин связывается с их внутренней поверхностью и повреждает эпителий, в результате переваренная пища не всасывается и насекомое погибает от голода.

В последние годы ген бактериального токсина удалось ввести в клетки многих растений. В частности, специалисты компании «Monsanto» создали картофель «New Leaf» («Новый лист»), устойчивый к колорадскому жуку, Bt-кукурузу и Bt-хлопок, сою «Roundup Ready» и др. Однако использование Bt-культур вызывает сомнения из-за здоровья человека и безопасность окружающей среды. Так, многие задаются вопросом: если колорадский жук не ест ботву, полезен ли такой картофель? Нет уверенности в том, что растительная продукция с «генными добавками» не повлияет отрицательно на будущее поколение.

При этом перенос пыльцы генетически модифицированных культур на растения соседних полей приведёт к их генетическому загрязнению, последствия которого трудно предсказуемы. На биологическое разнообразие может повлиять гибель полезных насекомых, для которых Bt-культуры оказались опасными. Кроме того, возможно, появятся супервредители, так как исходные виды насекомых достаточно быстро могут приобрести устойчивость к бактериальному эндотоксину.

Растения, устойчивые к вирусам

Создание вирусоустойчивых сортов – ещё одно направление генной инженерии растений.

Для создания таких сельскохозяйственных растений используется так называемая перекрёстная защита. Сущность этого является в том, что растения, инфицированные одним видом вируса, становятся устойчивыми к другому, родственному вирусу, так как происходит своего вида вакцинация. В растения вводят ген ослабленного штамма вируса, что предотвращает его поражение более вирулентным (вызывающим заболевание) штаммом того же или близкородственного вируса.

Таким геном-защитником может служить ген, кодирующий у вируса синтез белка оболочки, окружающий нуклеиновую кислоту. Этот ген используется для создания in vitro с помощью обратной транскриптазы к ДНК - ДНК-копии. К ней присоединяют необходимые регуляторные элементы и с помощью специальным образом подготовленной Ti-плазмидой агробактерии переносят в растения. Трансформированные растительные клетки синтезируют белок оболочки вируса, а выращенные из них трансгенные растения либо совсем не заражаются его более вирулентными штаммами, либо дают слабую и запоздалую реакцию на вирусную инфекцию.

Это один из механизмов защитного действия вирусного гена, который до сих пор не вполне ясен и может сопровождаться нежелательными последствиями.

Генетическое модифицирование – новая версия сельского хозяйства

Генетическое модифицирование сельского хозяйства основано на использовании высокопродуктивных сортов растений или пород животных, полученных на основе генной селекции. Именно этим благородным делом занимаются десятилетиями генетики-селекционеры. Но их возможности ограничены рамками скрещиваний – скрещиваться и давать плодовитое потомство могут только особи, принадлежащие как правило, к одному и тому же виду. Картофель и кукуруза не обладают способностью поражать колорадского жука и кукурузного стеблевого мотылька, а безвредная для человека и животных бактерия Bacillus thuringinesis может их убивать. Генетики скрестить бациллу с картофелем не могут, а генные инженеры - могут. Генетическая селекция улучшает количественные характеристики сорта или породы (урожайность, устойчивость к заболеваниям, надои и др.); генная инженерия способна создать новое качество – перенести ген, его кодирующий, из одного биологического вида в другой, в частности, ген инсулина от человека в дрожжи. И генетически модифицированные дрожжи станут фабрикой инсулина.

Считается, что единственное принципиальное препятствие, стоящее перед генными инженерами,- это или их ограниченная фантазия, или ограниченное финансирование. Непреодолимых природных ограничений в генной инженерии, похоже, нет.

Генная инженерия: от анализа к синтезу

Как мы уже знаем именно в 1972г. Пол Берг впервые объединил в пробирке в единое целое два гена, выделенных из разных организмов. И получил «молекулярный» гибрид, или рекомбинантную ДНК, которая в природных условиях никак образоваться не могла. Затем такую рекомбинантную ДНК внесли в бактериальные клетки, создав, таким образом, первые трансгенные организмы, несущие гены бактерии и обезьяны, точнее онкогенного вируса обезьяны.

Затем были сконструированы микробы, несущие гены мушки дрозофилы, кролика, человека. Это вызвало тревогу.

Несколько ведущих американских учённых, в том числе сам Пол Берг, опубликовали в журнале «Сайенс» письмо, в котором призывали приостановить работы по генной инженерии до тех пор, пока не будут выработаны правила техники безопасности по обращению с трансгенными организмами. Предполагалось, что организмы, которые несут чужеродные гены, могут иметь свойства, опасные для человека и среды его обитания. Чисто умозрительно высказывалось мнение, что трансгенные организмы, созданные без учёта их вероятных экологических характеристик и не прошедшие совместной эволюции с природными организмами, «вырвавшись из пробирки на свободу», смогут бесконтрольно и неограниченно размножиться. Это приведёт к вытеснению природных организмов из мест их естественного обитания; последующей цепной реакции нарушений экологического равновесия; сокращению биоразнообразия; активации дремлющих, ранее не известных патогенных микроорганизмов; возникновению эпидемий ранее не известных болезней человека, животных и растений; «побегу» чужеродных генов из трансгенных организмов; хаотическому переносу генов в биосфере; появлению монстров, всё уничтожающих.

Две версии будущего: трансгенный рай или трансгенный апокалипсис

Кроме опасений биологического и экологического характера стали высказываться опасения нравственные, этические, философские, религиозные.

В 1973-1974гг. в дискуссию включились американские политики. В итоге на генно-инженерные работы был наложен временный мораторий – «запрет до выяснения обстоятельств». В течение запрета на основании всех имеющихся знаний следовало оценить все потенциальные опасности генной инженерии и сформулировать правила техники безопасности. В 1976г. Правила были созданы, запрет снят. По мере всё ускоряющегося развития строгость правил безопасности всё время снижалась. Первоначальные страхи оказались сильно преувеличенными.

В итоге 30-летнего мирового опыта генной инженерии стало ясно, что в процессе «мирной» генной инженерии что-либо мирного возникнуть не может. Первоначальная техника безопасности работ с трансгенными организмами исходила из того, что созданные химеры могут быть опасны, как чума, чёрная оспа, холера или сибирская язва. Поэтому с трансгенными микробами работали, словно они патогенны, в специальных инженерных сооружениях. Но постепенно становилось всё более очевидным: риск сильно преувеличен.

В общем, за все 30 лет интенсивного и всё расширяющегося применения генной инженерии ни одного случая возникновения опасности, связанной с трансгенными организмами, зарегистрировано не было.

Возникла новая отрасль промышленности – трансгенная биотехнология, основанная на конструировании и применении трансгенных организмов. Сейчас в США около 2500 генно-инженерных фирм. В каждой из них работают высококвалифицированные специалисты, которые конструируют организмы на основе вирусов, бактерий, грибов, животных, в том числе насекомых.

Когда речь идёт об опасности или безопасности трансгенных организмов и продуктов из них полученных, то самые распространённые точки зрения основываются преимущественно на «общих соображениях и здравом смысле». Вот, что обычно говорят те, кто против:

природа устроена разумно, любое вмешательство в неё всё только ухудшит;
поскольку сами учёные не могут со 100%-ной гарантией предсказать всё, особенно
отдалённые последствия применения трансгенных организмов, не надо этого делать вообще.

А вот аргументы тех, кто выступает за:

в течение миллиардов лет эволюции природа успешно «перепробовала» все
возможные варианты создания живых организмов, почему же деятельность человека по
конструированию изменённых организмов должна вызывать опасения?
в природе постоянно происходит перенос генов между разными организмами (в
особенности между микробами и вирусами), так что ничего принципиально нового
трансгенные организмы в природу не добавят.

Дискуссия о выгодах и опасностях применения трансгенных организмов обычно концентрируется вокруг главных вопросов о том, опасны ли продукты, полученные из трансгенных организмов и опасны ли сами трансгенные организмы для окружающей среды?

Защита здоровья и окружающей среды, или бесчестная борьба за экономические интересы?

Нужна ли международная организация, которая на основе предварительной экспертизы регулировала бы применение трансгенных организмов? Чтобы она разрешала или запрещала выпуск на рынок продуктов, полученных из таких организмов? Ведь семена, тем более пыльца границ не признают.

А если международное регулирование биотехнологии не нужно, не приведёт ли чересполосица национальных правил, регулирующих обращение с трансгенными организмами, к тому, что из стран, где такие правила «либеральны», трансгенные растения «убегут» в страны, где правила «консервативны»?

Даже если большинство стран и договорятся о согласовании правил оценки риска трансгенных организмов, как быть относительно профессиональных и моральных качеств чиновников и экспертов? Будут ли они одинаковыми, например, в США, Германии, Китае, России и в Папуа Новой Гвинее?

Если развивающиеся страны и подпишут, например Всемирную конвенцию о правилах интродукции трансгенных организмов, кто им заплатит за создание и поддержание соответствующих национальных ведомств, за консультации, экспертизу, мониторинг?

Примерно половина всех программ, разработанных ООН, UNIDO, UNEP, направлены на решение проблем, связанных с трансгенными организмами. Есть два главных документа: «Кодекс добровольно принимаемых правил, которые надлежит придерживаться при интродукции (выпуске) организмов в окружающую среду», подготовленный Секретариатом UNIDO и «Протокол по биобезопасности в рамках Конвенции по биологическому разнообразию» (UNEP).

Европейская точка зрения: отсутствие международно-согласованных правил применения трансгенных организмов приведёт к широкомасштабным экспериментам в открытой среде, вредные последствия которых могут быть необратимыми.

Итак, где же истина? Можно ли сделать рациональный выбор между определённой пользой и неопределённым риском? Правильный ответ таков: опасны или безопасны трансгенные растения и продукты на их основе, опасность или безопасность которых пока убедительно не показаны исходя из современного уровня знаний, разумнее избегать их употребления.

Продукты питания, модифицированные методами генной инженерии

Первое опытное растение было получено в 1983 году в институте растениеводства в Кёльне. Через 9 лет в Китае начали выращивать трансгенный табак, который не портили насекомые-вредители. Первыми коммерческими трансгенами были помидоры сорта «Flavr Savr», созданные компанией «Calgene» и появившиеся в супермаркетах США в 1994г. Однако некоторые проблемы, связанные с их производством и транспортировкой, привели к тому, что компания была вынуждена уже через три года снять сорт с производства. В дальнейшем были получены многие сорта различных сельскохозяйственных культур с искусственно изменённым генетическим кодом. Среди них наиболее распространена соя (коммерческое выращивание начато с 1995г.), она составляет свыше половины от общего урожая; на втором месте – кукуруза, а за ними – хлопок, масленичный рапс, табак и картофель.

Мировые лидеры в выращивании трансгенных растений – США, Аргентина, Канада и Китай. В России уже существует несколько экспериментальных «закрытых» полей с генетически модифированными (ГМ) культурами. По сообщению директора Центра «Биоинженерии» РАН академика К.Скрябина, некоторые из них заняты картофелем, устойчивым к колорадскому жуку и полученным на основе трёх наиболее распространенных российских сортов – «Луговского», «Невского» и «Елизаветы».

Генетически модифицированные растения используются для производства, как продуктов питания, так и пищевых добавок. Например, из сои получается соевое молоко, которое заменяет натуральное для многих грудных детей. ГМ сырьё обеспечивает большую часть потребности в растительном масле и пищевом белке. Соевый лецитин (Е322) используется как эмульгатор и стабилизатор в кондитерской промышленности, а шкурки соевых бобов – при производстве отрубей, хлопьев и закусок. Помимо этого, ГМ-соя широко применяется в пищевой промышленности и в качестве дешёвого наполнителя. Она в значительном количестве входит в состав таких продуктов, как хлеб, колбаса, шоколад и др.

Модифицированные картофель и кукурузу используют для приготовления чипсов, а также перерабатывают на крахмал, который применяют в качестве загустителей, студнеобразователей и желирующих веществ в кондитерской и хлебопекарной промышленности, а также при производстве многих соусов, кетчупов, майонезов. Кукурузное и рапсовое масло используют в виде добавок в маргарин, выпечку, бисквиты и т.д.

Несмотря на то, что на мировом рынке всё больше появляется продуктов, полученных с использованием генетически модифицированных источников, потребители всё-таки настороженно относятся к ним, и не торопятся переходить на «пищу Франкенштейна».

Проблема продуктов питания, модифицированных на основе генной инженерии, вызвала бурную полемику в обществе. Главный аргумент сторонников генетической пищи – характеристики самих сельскохозяйственных культур, которым биоинженеры прибавили немало полезных для потребителя свойств. Они менее прихотливы и более устойчивы к болезням, насекомым-вредителям, а главное – к пестицидам, которыми обрабатываются поля и чей вред на человеческий организм давно доказан. Продукты из них лучшего качества и товарного вида, обладают повышенной пищевой ценностью и дольше хранятся.

Так, из «улучшенных» генными инженерами кукурузы, соевых бобов и рапса получается растительное масло, в котором снижено количество насыщенных жиров. В «новых» картофеле и кукурузе больше крахмала и меньше воды. Такой картофель при жарке требует немного масла, из него получаются воздушные чипсы и картофель фри, который сравнительно с немодифицированными продуктами легче усваивается. «Золотой» рис, полученный в 1999г., обогащён каротином для профилактики слепоты у детей развивающихся стран, Гед рис – основной продукт питания.

Ещё недавно прогнозы генных инженеров о «съедобных вакцинах» выглядели как полная фантастика. Однако уже выращен табак, в генетический код, которого «вмонтирован» человеческий ген, отвечающий за выработку антител к вирусу кори. В ближайшем будущем, по утверждению учёных, будут созданы другие подобные растения с противовирусной начинкой. В перспективе это может стать одним из главных путей будущей иммунопрофилактики.

Основной вопрос: безопасны ли для человека продукты питания, полученные на основе генетически модифицированных источников, пока остается без однозначного ответа, хотя в последние годы стали известны результаты некоторых исследований, которые свидетельствуют о том, что генетически модифицированные продукты отрицательно влияют на живые организмы.

Так, британский профессор Арпад Пуштай (Arpad Pusztai), работавший в Государственном Институте Роветт (Rowett) города Абердин, в апреле 1998г. заявил в телевизионном интервью, что проведённые им эксперименты выявили необратимые изменения в организме крыс, питавшихся генетически модифицированным картофелем. Они страдали угнетением иммунной системы и различными нарушениями деятельности внутренних органов. Заявление учёного стало поводом для его увольнения с работы за «распространение заведомо ложной псевдонаучной информации».

Однако в феврале 1999г. независимая группа из 20 известных учёных после тщательного изучения опубликовала заключение о работе Арпада Пуштая, в котором полностью подтверждалась достоверность полученных им результатов. В связи с этим министр сельского хозяйства Великобритании был вынужден признать эксперименты заслуживающими внимания и рассмотреть вопрос о запрещении продаж генетически модифицированных продуктов без всестороннего исследования и предварительного лицензирования.

Помимо этого, выявлено, что один из сортов генетически модифицированной сои опасен для людей, он давал аллергию на орехи. Этот генно-модифицированный продукт получен одной из крупнейших компаний по производству семян «Pioneer Hybrid International» после введения в соевую ДНК гена бразильского ореха, запасной белок, которого богат такими аминокислотами, как цистеин и метионин. Компания была вынуждена выплатить компенсацию пострадавшим, а проект свернуть.

Компоненты, содержащиеся в генетически модифицированных продуктах, могут быть не только аллергенами, но и высокотоксичными, то есть наносящими вред живому организму химическими веществами. Так, через несколько лет применения появились сообщения о серьёзных побочных эффектах от использования пищевой добавки, известной как аспартам (Е 951).

По химическому строению аспартам – метилированный дипептид, состоящий из остатков двух аминокислот – аспарагиновой кислоты и фенилаланина. Добавленный в пищу в ничтожных количествах, он полностью заменяет сахар (слаще сахара почти в 200 раз). В связи с этим аспартам относят к классу подсластителей, то есть низкокалорийных веществ несахарной природы, придающих пищевым продуктам и готовой пищи сладкий вкус. Часто подсластители путают с сахарозаменителями, которые по химической природе представляют собой углеводы и обладают повышенной калорийностью.

Аспартам выпускается под различными торговыми марками: «NutraSweet», «Sucrelle», «Equal», «Spoonful», «Canderel», «Holy Line» и др. На российском рынке его можно встретить также в составе многокомпонентных смесей подсластителей, таких, как «аспасвит», «аспартин», «сламикс», «евросвит», «сладекс» и др.

Долгие годы, считаясь совершенно безвредным веществом, аспартам был допущен к применению в пищевом и фармацевтическом производстве более чем в 100 странах мира. Его рекомендовали больным сахарным диабетом, а также тем, кто страдал ожирением или опасался кариеса. Он применяется при производстве более 5 тыс. наименований продуктов: безалкогольных напитков, йогуртов, молочных десертов, мороженого, кремов, жевательной резинки и других.

Особенно удобен аспартам для подслащивания пищевых продуктов, которые не требуют тепловой обработки. Кроме того, его можно использовать при моментальной пастеризации и быстром охлаждении. Однако в продуктах, которые подвергаются нагреванию, его применение нецелесообразно. Это связано с тем, что при всех замечательных свойствах у данного подсластителя есть два недостатка: он плохо растворяется в воде и не выдерживает высокой температуры. Сказанное усложняет процесс приготовления пищевых продуктов и ограничивает использование аспартама в таких областях, как хлебопекарная и другие виды пищевой промышленности, где технологически требуется повышение температуры.

При продолжительном воздействии температуры выше 30 С компоненты аспартама разделяются, причём сладость теряется, кроме того, метанол превращается в формальдегид. Последнее вещество с резким запахом вызывает свёртываемость белковых веществ и относится к категории ядовитых. В дальнейшем из формальдегида образуется муравьиная кислота, вызывающая нарушение кислотно-щелочного равновесия. Метаноловая токсичность по симптомам похожа на рассеянный склероз, поэтому больным нередко ошибочно ставили этот диагноз. Однако если рассеянный склероз не является смертельным диагнозом, то метаноловая токсичность смертельна.

Образовавшийся фенилаланин способен оказать чрезвычайно токсичное действие, особенно на нервную систему. Существует наследственное заболевание, обусловленное его избыточностью и известно как фенилкетонурия. Дети, родившиеся с названным наследственным недугом, подвержены судорогам и страдают умственной отсталостью. Причина этой болезни во врождённом дефекте фермента фенилаланингидроксилазы.

Последние достижения медицинской генетики установили, что эффективно усваивать фенилаланин могут даже не все здоровые люди. Поэтому дополнительное введение в организм данной аминокислоты не просто значительно повышает её уровень в крови, а представляет серьёзную опасность для работы мозга.

В связи со сказанным, аспартам противопоказан больным гомозиготной фенилкетонурией, и о его присутствии должно быть указано на этикетке пищевого продукта. Однако обычно запись «содержит фенилаланин, противопоказан для больных фенилкетонурией» делается таким мелким шрифтом, что её редко кто читает. Но, тем не менее, аспартам – пока единственный генетически созданный химический препарат на американском рынке, имеющий чёткую маркировку. Это оказалось возможным только после того, как стало известно относительно большое число явных подтверждений опасной токсичности аспартама, а наиболее популярные газеты и журналы США не назвали его «сладкой отравой».

Устойчивость к антибиотикам – ещё одна широко обсуждаемая проблема, связанная с генетически модифицированной пищей. В биоинженерной технологии гены устойчивости к этим лекарственным препаратам много лет используются в качестве маркеров при подготовке векторных систем, трансформирующих растительную клетку. Так, при выведении томатов сорта «Flavr Savr» использовался ген устойчивости к каналицину, а генетически модифицированной кукурузы – к ампициллину.

К сожалению, до сих пор не найден способ удаления этих маркерных генов после трансформации. Их наличие в генетически модифицированных продуктах и вызывает беспокойство медиков. Причина в том, что маркерные гены устойчивости к антибиотикам по каким-либо причинам могут быть не переварены со всей оставшейся ДНК и попадут в геном бактерий, обитающих в кишечнике человека. После выведения бактерий из организма с фекалиями, такие гены распространятся в окружающей среде и передадутся другим болезнетворным бактериям, которые станут невосприимчивыми к действию антибиотиков этой группы. Появление подобных супермикробов может привести к возникновению болезней, которые невозможно будет вылечить имеющимися лекарственными средствами.

11 Июля 2008

Генная инженерия (генетическая инженерия) – совокупность методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы .

Генная инженерия – составная часть современной биотехнологии, теоретической основой ее является молекулярная биология, генетика. Суть новой технологии заключается в направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма (in vitro) с последующим внедрением созданных конструкций в живой организм. В результате достигается их включение и активность в данном организме и у его потомства. Возможности генной инженерии – генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение генно-инженерно-модифицированных (генетически модифицированных, трансгенных) организмов с новыми уникальными генетическими, биохимическими и физиологическими свойствами и признаками, делают это направление стратегическим.

С точки зрения методологии генная инженерия сочетает в себе фундаментальные принципы (генетика, клеточная теория, молекулярная биология, системная биология), достижения самых современных постгеномных наук: геномики, метаболомики, протеомики с реальными достижениями в прикладных направлениях: биомедицина, агробиотехнология, биоэнергетика, биофармакология, биоиндустрия и т.д.

Генная инженерия относится (наряду с биотехнологией, генетикой, молекулярной биологией, и рядом других наук о жизни) к сфере естественных наук.

Историческая справка

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. В 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК, на рубеже 50 – 60-х годов 20 века были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E.coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 1970 году Г.Смитом был впервые выделен ряд ферментов – рестриктаз, пригодных для генно-инженерных целей. Г.Смит установил, что полученный из бактерий очищенный фермент HindII сохраняет способность разрезать молекулы нуклеиновых кислот (нуклеазная активность), характерную для живых бактерий. Комбинирование ДНК-рестриктаз (для разрезания молекул ДНК на определенные фрагменты) и выделенных еще в 1967 г. ферментов – ДНК-лигаз (для «сшивания» фрагментов в произвольной последовательности) по праву можно считать центральным звеном в технологии генной инженерии.

Таким образом, к началу 70-х годов были сформулированы основные принципы функционирования нуклеиновых кислот и белков в живом организме и созданы теоретические предпосылки генной инженерии

Академик А.А. Баев был первым в нашей стране ученым, который поверил в перспективность генной инженерии и возглавил исследования в этой области. Генетическая инженерия (по его определению) – конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе – создание искусственных генетических программ.

Задачи и методы генной инженерии

Хорошо известно, что традиционная селекция имеет целый ряд ограничений, которые препятствуют получению новых пород животных, сортов растений или рас практически ценных микроорганизмов:

1. отсутствие рекомбинации у неродственных видов. Между видами существуют жесткие барьеры, затрудняющие естественную рекомбинацию.
2. невозможность управлять процессом рекомбинации в организме извне. Отсутствие гомологии между хромосомами приводит к неспособности сближаться и обмениваться отдельными участками (и генами) в процессе образования половых клеток. В результате становится невозможным перенос нужных генов и обеспечение оптимального сочетания в новом организме генов, полученных от разных родительских форм;
3. невозможность точно задать признаки и свойства потомства, т.к. процесс рекомбинации – статистический.

Природные механизмы, стоящие на страже чистоты и стабильности генома организма, практически невозможно преодолеть методами классической селекции.

Технология получения генетически модифицированных организмов (ГМО) принципиально решает вопросы преодоления всех естественных и межвидовых рекомбинационных и репродуктивных барьеров. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Генная инженерия позволяет оперировать любыми генами, даже синтезированными искусственно или принадлежащими не родственным организмам, переносить их от одного вида к другому, комбинировать в произвольном порядке.

Технология включает несколько этапов создания ГМО:

1. Получение изолированного гена.
2. Введение гена в вектор для встраивания в организм.
3. Перенос вектора с конструкцией в модифицируемый организм-рецепиент.
4. Молекулярное клонирование.
5. Отбор ГМО.

Первый этап – синтез, выделение и идентификация целевых фрагментов ДНК или РНК и регуляторных элементов очень хорошо разработан и автоматизирован. Изолированный ген может быть также получен из фаговой библиотеки.

Второй этап – создание in vitro (в пробирке) генетической конструкции (трансгена), которая содержит один или несколько фрагментов ДНК (кодирующих последовательность аминокислот белков) в совокупности с регуляторными элементами (последние обеспечивают активность трансгенов в организме). Далее трансгены встраивают в ДНК вектора для клонирования, используя инструментарий генной инженерии – рестриктазы и лигазы. За открытие рестриктаз Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии (1978 г.). Как правило, в качестве вектора используют плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК бактериального происхождения.

Следующий этап – собственно «генетическая модификация» (трансформация), т.е. перенос конструкции «вектор – встроенная ДНК» в отдельные живые клетки. Введение готового гена в наследственный аппарат клеток растений и животных представляет собой сложную задачу, которая была решена после изучения особенностей внедрения чужеродной ДНК (вируса или бактерии) в генетический аппарат клетки. Процесс трансфекции был использован как принцип введения генетического материала в клетку.

Если трансформация прошла успешно, то после эффективной репликации из одной трансформированной клетки возникает множество дочерних клеток, содержащих искусственно созданную генетическую конструкцию. Основой для появления у организма нового признака служит биосинтез новых для организма белков – продуктов трансгена, например, растений – устойчивости к засухе или насекомым-вредителям у ГМ растений.

Для одноклеточных организмов процесс генетической модификации ограничивается встраиванием рекомбинантной плазмиды с последующим отбором модифицированных потомков (клонов). Для высших многоклеточных организмов, например, растений, то обязательным является включение конструкции в ДНК хромосом или клеточных органелл (хлоропластов, митохондрий) с последующей регенерацией целого растения из отдельной изолированной клетки на питательных средах. В случае животных, клетки с измененным генотипом вводят в бластоциды суррогатной матери. Первые ГМ растения были получены в 1982 году учеными из Института растениеводства в Кельне и компании Monsanto.

Основные направления

Постгеномная эра в первой декаде XXI-ого века подняла на новый уровень развитие генной инженерии. Так называемый Кельнский Протокол «На пути к биоэкономике, основанной на знаниях» , определил биоэкономику как «преобразование знаний наук о жизни в новую, устойчивую, экологически эффективную и конкурентоспособную продукцию». Дорожная карта генной инженерии содержит целый ряд направлений: генотерапия, биоиндустрия, технологии, основанные на стволовых клетках животных, ГМ растения, ГМ животные и т.д.

Генетически модифицированные растения

Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами.

Для двудольных растений существует естественный вектор для горизонтального переноса генов: плазмиды агробактерий. Что касается однодольных, то, хотя в последние годы достигнуты определенные успехи в их трансформации агробактериальными векторами, все же подобный путь трансформации встречает существенные затруднения.

Для трансформации устойчивых к агробактериям растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку они включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др.

После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.

Первые трансгенные растения (растения табака со встроенными генами из микроорганизмов) были получены в 1983 г. Первые успешные полевые испытания трансгенных растений (устойчивые к вирусной инфекции растения табака) были проведены в США уже в 1986 г.

После прохождения всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность и т.д. первые трансгенные продукты появились в продаже в США в 1994 г. Это были томаты Flavr Savr с замедленным созреванием, созданные фирмой «Calgen», а также гербицид-устойчивая соя компании «Monsanto». Уже через 1-2 года биотехнологические фирмы поставили на рынок целый ряд генетически измененных растений: томатов, кукурузы, картофеля, табака, сои, рапса, кабачков, редиса, хлопчатника.

В РФ возможность получения трансгенного картофеля методом бактериальной трансформации с использованием Agrobacterium tumefaciens была показана в 1990 г.

В настоящее время получением и испытанием генетически модифицированных растений занимаются сотни коммерческих фирм во всем мире с совокупным капиталом более 100 миллиардов долларов. Генно-инженерная биотехнология растений уже стала важной отраслью производства продовольствия и других полезных продуктов, привлекающей значительные людские ресурсы и финансовые потоки.

В России под руководством академика К.Г. Скрябина (Центр «Биоинженерия» РАН) получены и охарактеризованы ГМ сорта картофеля Елизавета плюс и Луговской плюс, устойчивые к колорадскому жуку. По результатам проверки Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека на основании экспертного заключения ГУ НИИ питания РАМН данные сорта прошли государственную регистрацию, внесены в государственный реестр и разрешены для ввоза, изготовления и оборота на территории РФ.

Данные ГМ сорта картофеля принципиально отличается от обычных наличием в его геноме встроенного гена, определяющего 100%-ю защиту урожая от колорадского жука без использования каких-либо химических средств.

Первая волна трансгенных растений, допущенных для практического применения, содержала дополнительные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредителям, порче при хранении, стрессам).

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название «метаболическая инженерия». При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие «лекарственные» белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.

Генетически модифицированные животные

Клетки животных существенно отличаются от бактериальных по своей способности поглощать чужеродную ДНК, поэтому методы и способы способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и рыб остаются в центре внимания генных инженеров.

Наиболее изученное в генетическом отношении млекопитающее – мыши. Первый успех относится к 1980 году, когда Д. Гордон с сотрудниками продемонстрировал возможность введения и интеграции чужеродной ДНК в геном мышей. Интеграция была стабильной и сохранялась у потомства. Трансформацию производят микроинъекцией клонированных генов в один или оба пронуклеуса (ядра) только что эмбриона на стадии одной клетки (зиготы). Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген β-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер – от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10 – 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

Таким методом получены генно-инженерные крысы, кролики, овцы, свиньи, козы, телята и другие млекопитающие. В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена веществ сказалось на содержании жира. У таких животных ингибировались процессы липогенеза и активировался синтез белка. К изменению обмена веществ приводило и встраивание генов инсулиноподобного фактора. ГМ свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной системы.

Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной железы. Если поставить гены чужих белков под контроль казеинового промотора, то экспрессия этих генов будет мощной и стабильной, а белок будет накапливаться в молоке. С помощью животных-биореакторов (трансгенные коровы) уже получено молоко, в котором содержится человеческий белок лактоферрин. Этот белок планируется применять для профилактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью: больные СПИДом, недоношенные младенцы, больные раком, прошедшие радиотерапию.

Важное направление трансгеноза – получение устойчивых к болезням животных. Ген интерферона, относящийся к защитным белкам, встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость – они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено.

Применение в научных исследованиях

Нокаут гена (gene knockout) – техника удаления одного или большего количества генов, что позволяет исследовать функции гена. Для получения нокаутных мышей полученную генно-инженерную конструкцию вводят в эмбриональные стволовые клетки, где конструкция подвергается соматической рекомбинации и замещает нормальный ген, а измененные клетки имплантируют в бластоцист суррогатной матери. Сходным способом получают нокаут у растений и микроорганизмов.

Искусственная экспрессия – добавление в организм гена, которого у него ранее не было, также с целями изучения функции генов. Визуализация продуктов генов – используется для изучения локализации продукта гена. Замещение нормального гена на сконструрованный ген, слитый с репортёрным элементом, (например, с геном зелёного флуоресцентного белка) обеспечивает визуализацию продукта генной модификации.

Исследование механизма экспрессии. Небольшой участок ДНК, расположенный перед кодирующей областью (промотор) и служащий для связывания факторов транскрипции, вводят в организм, поставив после него вместо собственного гена репортерный, например, GFP, катализирующий легко обнаруживаемую реакцию. Кроме того, что функционирование промотора в тех или иных тканях в тот или иной момент становится хорошо заметным, такие эксперименты позволяют исследовать структуру промотора, убирая или добавляя к нему фрагменты ДНК, а также искусственно усиливать экспрессию генов.

Биобезопасность генно-инженерной деятельности

Еще в 1975 г. ученые всего мира на Асиломарской конференции подняли важнейший вопрос: не окажет ли появление ГМО потенциально негативного воздействия на биологическое разнообразие? С этого момента одновременно с бурным развитием генной инженерии стало развиваться новое направление - биобезопасность. Главная ее задача - оценить не несет ли использование ГМО нежелательное воздействие на окружающую среду, здоровье человека и животных, а главная цель - открыть путь к использованию достижений современной биотехнологии, гарантируя при этом безопасность.

Стратегия биобезопасности основывается на научном исследовании особенностей ГМО, опыте обращения с ним, а также информации о его предполагаемом использовании и окружающей среде, в которую он будет интродуцирован. Совместными многолетними усилиями международных организаций (ЮНЕП, ВОЗ, ОЭСР), экспертов из разных стран, в т. ч. России, были разработаны базовые понятия и процедуры: биологическая безопасность, биологическая опасность, риск, оценка рисков. Только после того, как полный цикл проверок будет успешно осуществлен, готовится научное заключение о биобезопасности ГМО. В 2005 г. ВОЗ опубликовало доклад, согласно которому употребление зарегистрированных в качестве пищи ГМ растений также безопасно, как их традиционных аналогов.

Как обеспечивается биобезопасность в России? Началом включения России в мировую систему биобезопасности можно считать ратификацию «Конвенции о биоразнообразии» в 1995 году. С этого момента началось формирование национальной системы биобезопасности, отправной точкой которой явилось вступление в силу Федерального закона РФ «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» (1996 г.). ФЗ устанавливает основные понятия и принципы государственного регулирования и контроля всех видов работ с ГМО. ФЗ устанавливает уровни риска в зависимости от типа ГМО и вида работ, дает определения замкнутой и открытой систем, выпуска ГМО и т.д.

За прошедшие годы в России сформировалась одна из самых жестких систем регулирования. Неординарен тот факт, что система государственного регулирования ГМО стартовала превентивно, в 1996 году, до того, как реальные генно-инженерные организмы были заявлены для коммерциализации на территории России (первый ГМО – ГМ соя - была зарегистрирована для пищевого использования в 1999г.). Базовыми правовыми инструментами служат государственная регистрация генно-инженерно-модифицированных организмов, а также продукции, полученной из них или их содержащей, предназначенных для использования в качестве пищи и кормов.

Для понимания современной ситуации важен факт, что в течение 25 лет, прошедших с момента первого выхода ГМ растений на рынок, не было выявлено ни одного достоверного отрицательного воздействия их на окружающую среду и здоровье человека и животных ни в ходе испытаний, ни при коммерческом использовании. Только в одном из мировых источников – отчете авторитетного общества AGBIOS «Essential Biosafety» содержится более 1000 ссылок на исследования, доказывающие, что пища и корма, полученные из биотехнологических культур, настолько же безопасны, насколько безопасны и традиционные продукты. Однако на сегодняшний день в России отсутствует нормативно-правовая база, которая позволила бы осуществлять на территории нашей страны выпуск в окружающую среду ГМ растений, а также продукции, полученной из них или их содержащей. Как следствие – на 2010 год ни одно ГМ растение не выращивается на территории Российской Федерации в коммерческих целях.

По прогнозу, согласно Кельнскому Протоколу (2007 г), к 2030 г. отношение к сельскохозяйственным ГМ культурам изменится в сторону одобрения их использования.

Достижения и перспективы развития

Генная инженерия в медицине

Потребности здравоохранения, необходимость решения проблем старения населения формируют устойчивый спрос на генно-инженерные фармпрепараты (с годовым объемом продаж в 26 млрд. долл. США) и лечебно-косметические средства из растительного и животного сырья (с годовым объемом продаж около 40 млрд. долл. США).

Среди многих достижений генной инженерии, получивших применение в медицине, наиболее значительное – получение человеческого инсулина в промышленных масштабах.

В настоящее время по данным ВОЗ в мире насчитывается около 110 млн. людей, страдающих диабетом. Инсулин, инъекции которого показаны больным этим заболеванием, уже давно получают из органов животных и используют в медицинской практике. Однако многолетнее применение животного инсулина ведет к необратимому поражению многих органов пациента из-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму животного инсулина. Но даже потребности в животном инсулине до недавнего времени удовлетворялись всего на 60 – 70%. Генные инженеры в качестве первой практической задачи клонировали ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. В России получение генно-инженерного человеческого инсулина – Инсурана ведется в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Сегодня отечественный инсулин производится в объеме, достаточном для обеспечения больных диабетом г. Москвы. Вместе с тем, потребность всего российского рынка в генно-инженерном инсулине удовлетворяется, в основном, импортными поставками. Мировой рынок инсулина составляет в настоящее время более 400 млн. долларов, ежегодное потребление около 2500 кг.

Развитие генной инженерии в 80-х годах прошлого столетия обеспечило хороший задел России в создании генно-инженерных штаммов микроорганизмов с заданными свойствами – продуцентов биологически активных веществ, в разработке генно-инженерных методов реконструирования генетического материала вирусов, в получении лекарственных субстанций, в том числе и с использованием компьютерного моделирования. До стадии производства доведены рекомбинантный интерферон и лекарственные формы на его основе медицинского и ветеринарного назначения, интерлейкин (b-лейкин), эритропоэтин. Несмотря на растущий спрос на высокоочищенные препараты, отечественное производство иммуноглобулинов, альбумина, плазмола обеспечивает 20% потребностей внутреннего рынка.

Активно ведутся исследования по разработке вакцин для профилактики и лечения гепатитов, СПИДа и ряда других заболеваний, а также конъюгированных вакцин нового поколения против наиболее социально значимых инфекций. Полимер-субъединичные вакцины нового поколения состоят из высокоочищенных протективных антигенов различной природы и носителя – иммуностимулятора полиоксидония, обеспечивающего повышенный уровень специфического иммунного ответа. Прививки против подавляющего большинства известных инфекций Россия могла бы обеспечить на базе собственного иммунологического производства. Полностью отсутствует только производство вакцины против краснухи.

Генная инженерия для сельского хозяйства

Генетическое улучшение сельскохозяйственных культур и декоративных растений представляет собой длительный и непрерывный процесс с использованием все более точных и предсказуемых технологий. В научном отчете ООН (за 1989 год) сказано следующее: «Поскольку молекулярные методы наиболее точны, те, кто их применяет, в большей степени уверены в том, какими признаками они наделяют растения, и, следовательно, реже получают незапланированные эффекты, чем при использовании обычных методов селекции.»

Преимущества новых технологий уже широко используются в таких странах, как США, Аргентина, Индия, Китай и Бразилия, где генетически модифицированные культуры возделывают на больших территориях.

Новые технологии также имеют большое значение для малоимущих фермеров и жителей бедных стран, особенно женщин и детей. Например, генетически модифицированные, устойчивые к вредителям, хлопчатник и кукуруза требуют применения инсектицидов в значительно меньших объемах (что делает труд на ферме более безопасным). Такие культуры способствуют повышению урожайности, получению фермерами более высоких доходов, снижению уровня бедности и риска отравления населения химическими пестицидами, что особенно характерно для ряда стран, в том числе для Индии, Китая, ЮАР и Филиппин.

Самыми распространенными ГМ растениями являются культуры, устойчивые к недорогим, наименее токсичным и наиболее широко используемым гербицидам. Возделывание таких культур позволяет получать более высокий урожай с гектара, избавиться от изнурительной ручной прополки, тратить меньше средств за счет минимальной или беспахотной обработки земли, что, в свою очередь, приводит к снижению эрозии почвы.

В 2009 году произошла замена генетически модифицированных культур первого поколения продуктами второго поколения, что впервые привело к увеличению урожайности per se. Пример биотехнологической культуры нового класса (над созданием которой работали многие исследователи) – устойчивая к глифосату соя RReady2Yield™ , выращивалась в 2009 году в США и Канаде более чем на 0.5 миллионах га.

Внедрение генной инженерии в современную агробиологию может быть проиллюстрировано следующими фактами из ряда зарубежных экспертных обзоров, в том числе, из ежегодного обзора независимой Международной службы по мониторингу за применением агробиотехнологий (ISAАA), возглавляемой известным в мире экспертом Клайвом Джеймсом (Claiv James): (www.isaaa.org)

В 2009 году в 25 странах мира выращивали ГМ культуры на площади 134 млн. га (что составляет 9% от 1,5 млрд. га всех пахотных земель в мире). Шесть стран ЕС (из 27) возделывали Bt кукурузу, и в 2009 году площади ее посевов достигли более 94 750 га. Анализ мирового экономического эффекта использования биотехнологических культур за период с 1996 по 2008 г.г. показывает рост прибыли в размере 51,9 миллиардов долларов благодаря двум источникам: во-первых, это сокращение производственных затрат (50%) и, во-вторых, значительная прибавка урожая (50%) в размере 167 миллионов тонн.

В 2009 году общая рыночная стоимость семян ГМ культур в мире составила 10.5 миллиардов долларов. Общая стоимость по зерну биотех кукурузы и сои, а также хлопчатника в 2008 году составила 130 млрд. долларов, и ожидается, что ее ежегодный рост составит 10 – 15%.

Подсчитано, что в случае полного принятия биотехнологии, к концу периода 2006 – 2015 г. прибыль всех стран в пересчете на ВВП вырастет на 210 млрд. долл. США в год.

Наблюдения, проводимые с начала применения в сельском хозяйстве устойчивых к гербицидам сельскохозяйственных культур, убедительно доказывают, что фермеры получили возможность более эффективно бороться с сорняками. При этом рыхление и распахивание полей утрачивают свое значение как средства борьбы с сорняками. В итоге снижается расход тракторного топлива, улучшается структура почвы и предотвращается ее эрозия. Целевые инсектицидные программы выращивания Bt хлопчатника предусматривают меньшее число опрыскиваний посевов и, следовательно, меньшее количество выездов техники на поля, что приводит к сокращению эрозии почв. Все это невольно содействует внедрению консервирующей технологии обработки почвы, направленной на снижение почвенной эрозии, уровня углекислого газа и уменьшения потери воды.

Для современного состояния науки характерен комплексный подход, создание единых технологических платформ для проведения широкого спектра исследований. Они объединяют не только биотехнологию, молекулярную биологию и генную инженерию, но также и химию, физику, биоинформатику, транскриптомику, протеомику, метаболомику.

Рекомендуемая литература
1. Дж. Уотсон. Молекулярная биология гена. М.: Мир. 1978.
2. Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир. 1981
3. С.Н. Щелкунов «Генетическая инженерия». Новосибирск, издательство Сибирского Университета, 2008
4. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002
5. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Под редакцией Дж. Дрейпера, Р.Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. М.: «Мир». 1991.
6. Агробиотехнология в мире. Под ред. Скрябина К.Г. М.: Центр «Биоинженерия» РАН, 2008. – 135 с.
7. Кларк. Д., Рассел Л. Молекулярная биология простой и занимательный подход. М.: ЗАО «Компания КОНД». 2004

Ссылки
1. «О государственном регулировании генно-инженерной деятельности». ФЗ-86 в ред. 2000 г., ст.1
2. Кельнский Протокол, Cologne Paper, принят на конференции «На пути к Биоэкономике, основанной на знаниях» (Кельн, 30 мая 2007 г.), организованной Европейским Союзом в период президентства Германии в ЕС.