Дифференциальные питательные среды. Сухие среды. Профаг – это

1.1. Среды Эндо, Левина, Плоскирева . Используют как дифференциально-диагностические элективные среды для культивирования бактерий кишечной группы (содержит лактозу). Микроорганизмы, ферментирующие находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - лактозоположительные (колонии красного цвета с металлическим блеском или без блеска). Колонии микробов, не ферментирующие лактозу, бесцветные - лактозонегативные – нежно-розовые, прозрачные, пропускающие свет.

К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

1.2. Среды с крахмалом используют для выявления микроорганизмов, образующих амилазу. Наличие фермента определяется при добавлении к культуре несколько капель раствора Люголя

(цвет среды не изменяется). Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

1.3. Молоко. При росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается.

2. Коммерческие наборы – для изучения биохимических свойств (идентификации микроорганизмов по сахаролитической и протеолитической активности).

2.1. Среды Гисса с углеводами (глюкоза, лактоза, сахароза, арабиноза и другие) в которых выявляют ферментативную активности микроорганизмов.Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Соломенно-желтого цвета среда при положительной реакции меняет цвет на красный или интенсивно розовый, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее цвета. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах.

Состав: пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде (фуксин)- 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4.

2.2. Среды для изучения протеолитических свойств

Среды с желатином . В некоторых бактериях (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т. д.) протеолитические ферменты выявля­ются путем разжижения желатины.

Среды с молоком. Микроорганизмы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки.

Среды с пептоном. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образования определяют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают полосками и, после посева культуры на МПБ, помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной раствором, содержащим ацетат свинца, бикарбонат натрия, происходит образование сульфата свинца - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты.

2.3. Микротесты - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды.

2.4. Системы индикаторные бумажные (СИБ) - дифференциально-диагностические среды на фильтровальной бумаге.

Для культивирования и дифференциации анаэробных микроорганизмов: среда Вильсон-Блера . Готовят из мясо-пептонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na 2 S0 3 , хлорид железо FeCl 2 . На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара. При этом осуществляется восстановление Na 2 S0 3 в Na 2 S (сульфит натрия), который соединяясь с хлоридом железа, образует сульфат железа черного цвета. Разрыв питательной среды связан с газообразованием.

к работе № 2

Микроорганизмам, как всему живому, присущи три основные физиологические функции: питание, дыхание и размножение.

Основные понятия темы:

Колония – видимое невооруженным взглядом скопление микробов на плотной питательной среде, выросшее из одной клетки.

Колония - это потомство микробов, выросших из одной клетки. Т.к. все микробы в колонии выросли из одной клетки, они относятся к одному виду, т.е. в каждой изолированной колонии (отдельно стоящей, не сливающейся с другими колониями) содержится чистая культура.

Чистая культура – популяция микроорганизмов, состоящая из особей одного вида.

Индикация – обнаружение возбудителя в исследуемом материале (определение рода)

Идентификация – определение вида, типа, биовара, серовара, фаговара выделенной чистой культуры.

к работе № 3

Дыхание микроорганизмов – биологическое окисление субстрата с выделением необходимой для метаболизма энергии. По типу дыхания микроорганизмы делятся на 3 основные группы: аэробы могут жить только в присутствии кислорода (холерный вибрион); факультативные анаэробы могут жить при любом процентном содержании кислорода и без него (кишечная палочка); анаэробы (облигатные) – только в отсутствие кислорода (возбудители газовой гангрены). При культивировании облигатных анаэробов требуется создание особых условий анаэробиоза . При этом используют особые приборы и среды (анаэростат, эксикатор, среды тиогликолиевая, Вильсона-Блера).

Классификация питательных сред производится по их составу и назначению

1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные

Различают группу сред общего назначения - простых. К этой группе относят мясо-пептонный бульон (простой питательный бульон), мясо-пептонный агар {простой питательный агар), питательный желатин. Эти среды применяются для выращивания многих патогенных микробов. Среды общего назначения, или простые питательные среды, готовятся обычно из гидролизатов с добавлением пептона и хлористого натрия. Их используют также как основу для приготовления сложных сред.

Также по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды. 2. По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные ).

Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

3.По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования {универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

Консервирующие питательные среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь, гипертонический раствор, глицериновый консервант с LiCl 2 , раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия.

Среды обогащения для бактерий

Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолевая среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества - соли жёлчных кислот, тетратионат Na+, теллурит К, антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зелёный и др.

Также по назначению различают среды элективные, специальные и дифференциально-диагностические.

Среды элективные (селективные, избирательные, накопления, обогащения). Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены, или на добавление ингибиторов, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определённом значении pH или добавлении ингибиторов обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микробов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого среда будет элективной. Примером элективных сред являются желчный бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева – для выращивания микробов семейства кишечных, щелочная пептонная вода – для холерного вибриона.

Желчный бульон . К МПБ добавляют 10-20% бычьей желчи. Желчь подавляет рост коков и воздушной флоры, но благоприятна для размножения сальмонелл.

Селенитовый бульон . Состоит из фосфатного бульона с добавлением натриевой соли селенита, которая является ингибитором роста кокковой флоры, кишечной палочки, но не задерживает роста сальмонелл.

Среда Плоскирева . Плотная среда, содержащая ингибиторы кишечной палочки, коков, но благоприятная для роста шигелл и сальмонелл, размножение которых не тормозится бриллиантовым зелёным и желчными солями.

Пептонная вода . Содержит 1% пептона и 0,5% хлористого натрия. Среда является элективной для холерных вибрионов, т.к. они лучше других бактерий размножаются на “голодных средах”, особенно при щелочной реакции, потому что сами выделяют кислые продукты жизнедеятельности.

Специальные среды. Необходимы для культивирования бактерий, не растущих на простых питательных средах. Для некоторых организмов к простым питательным средам необходимо добавлять углеводы, кровь и др. дополнительные питательные вещества. Примерами простых питательных сред являются сахарный бульон и сахарный агар для стрептококка (готовится соответственно из МПБ и МПА, к которым добавляется 0,5-2% глюкозы).

Для пневмококков и менингококков специальной средой являются сывороточный бульон и сывороточный агар (для приготовления сывороточного бульона смешивают 1 часть МПБ с 2 частями свежей сыворотки, для получения, сывороточного агара к расплавленному МПА добавляется 10-25% стерильной лошадиной или бычьей сыворотки).

Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяют следующим образом:

1. Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д.

2. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для

обнаружения различных сахаролитических ферментов.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических свойств и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой с розоловой кислотой (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие фермента и расщепление введённого в среду ингредиента.

Примеры дифференциально-диагностических сред:

Среда Эндо . Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд . Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.

Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).

Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО 2 , СН 4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными – с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.

На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.

В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.

Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.

Применяются для разграничения отдельных видов или групп микроорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды микроорганизмов различаются между собой по биохимической активности вследствие неодинакового набора ферментов.

В состав ДДС входят:

1. Питательная основа, обеспечивающая размножение микроорганизмов

2. Определенный углевод - лактоза

3. Индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о сдвиге pH среды в кислотную сторону, вследствие ферментации соответствующего углевода.

ДДС активно применяются для дифференциации видов микроорганизмов семейства кишечных.

Элективные питательные среды

Предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида (или группы) из материалов, содержащих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании этих сред исходят из биологических особенностей, которые отличают микроорганизмы от большинства других. Например, избирательный рост стафилококков наблюдается при повышенной концентрации соли, холерного вибриона - в щелочной среде.

Разлив сред

1. Агаровых сред в чашки Петри:

а) расплавить на водяной бане, остудить до 45-50ºС с МПА

б) поставить чашку крышкой вверх

в) сосуд до средой взять в правую руку, держа его у огня

г) левой рукой вынуть пробку, зажав ее мизинцем и ладонью

д) обжечь горлышко бутылки со средой и двумя пальцами левой руки слегка приоткрыть крышку

е) ввести под нее горлышко бутыли, не касаясь им края чашки и налить 15-20 мл. среды.

Если посев проводят в день разлива среды, то её необходимо подсушить в термостате 20-30 минут в разобранном виде, открыто стороной вниз. Если посев проводят на следующий день, то чашки не подсушивая заворачивают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали и помещают в холодильник.

2. Агаровых среда в пробирки:

а) взять сосуд с расплавленной и остуженной до 45ºС средой

б) левой рукой взять пробирку

в) правой рукой извлечь пробку из пробирки, а левой рукой из сосуда со средой, зажав ее мизинцем и ладонью

г) обжечь края пробирки и сосуда со средой, внести в пробирку 3-5 мл среды

д) вновь обжечь горлышки емкостей, закрыть из пробками

Агаровые среды могут застывать в пробирках в виде:

1. Скошенного столбика

2. Комбинированного столбика

3. Столбика

Для получения скошенного и комбинированного столбика, пробирки с расплавленной агаровой массой укладывают в наклонном положении на специальную подставку, чтобы среда не заходила на 2/3 пробирки, не смачивала пробку. После застывания среды, пробирки ставят вертикально в штатив, дают стечь конденсату вниз. Пользоваться средой без конденсата нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.

Мясо-пептонный агар

Исследования бактерий требуют скрупулезной работы с многочисленным оборудованием и инструментарием. Чтобы микроорганизмы в лабораторных условиях максимально быстро размножались и могли поддерживать нормальную жизнедеятельность, используются специальные среды питательные. Их состав и биофизические условия подходят для активного роста бактериальной культуры.

Питательные среды. Микробиология и другие области применения

Колонии бактерий в лабораторных условиях выращиваются на чашках Петри, которые заполнены желеобразным или полужидким содержимым. Это и есть среды питательные, состав и свойства которых максимально приближены к естественным для качественного роста культуры.

Например, такая элективная среда пригодна только для размножения кишечной палочки. Тогда из посева множества бактерий на чашке Петри мы увидим только колонии той самой кишечной палочки и никакие больше. Прежде чем приступать к работе, необходимо хорошо знать метаболизм исследуемой бактерии, чтобы удачно ее отобрать из смеси других видов.

Твердые, полужидкие и жидкие питательные среды

Бактерии могут выращиваться не только на твердых субстратах. Среды питательные отличаются между собой по агрегатному состоянию, что зависит от состава при изготовлении. Изначально все они имеют жидкую консистенцию, а при добавлении желатина или агара в определенном процентном соотношении смесь застывает.

Жидкие питательные среды обычно находятся в пробирках. Если появляется необходимость выращивать бактерии в таких условиях, добавляют раствор с пробой культуры и ждут 2-3 суток. Результат может быть различным: выпадает осадок, появляется пленка, плавают мелкие хлопья или образуется мутный раствор.

Плотная питательная среда часто используется в микробиологическом исследовании для изучения свойств колоний бактерий. Такие среды всегда прозрачные или полупрозрачные, чтобы была возможность правильно определить цвет и форму культуры микроорганизмов.

Приготовление питательных сред

Очень просто готовятся такие субстраты, как мясопептонные смеси на основе бульона, желатина или агара. Если нужно сделать твердый или полужидкий субстрат, в жидкость добавляют соответственно 2-3% или 0,2-0,3% желатина или агара. Они играют главную роль в затвердевании смеси, но никак не являются источником питательных веществ. Таким образом, и получают среды питательные, которые пригодны для роста бактериальной культуры.

дифференциально-диагностические среды, специальные питательные среды, используемые для идентификации микроорганизмов, обладающих избирательной биохимической активностью по отношению к определённым веществам. В процессе развития микробы с помощью ферментов расщепляют входящие в состав среды определённые вещества, что устанавливают по изменению среды.

Ряд патогенных микроорганизмов разлагают углеводы, многоатомные спирты с образованием кислот и газов (углекислоты, водорода, метана), что указывает на принадлежность их к определённой группе или виду бактерий. Для установления этих свойств готовят жидкие или полужидкие Д.-д. с. с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннозой и др. углеводами, многоатомными спиртами (пёстрый ряд), с индикаторами (Андраде, Гисса), среды с молоком. Ферментативную способность микробов определяют по появлению газа или изменению цвета индикатора. Интенсивность кислотообразования из глюкозы определяют на среде Кларка, образования ацетилметилкарбонала - с помощью реакции Фогеса‑Проскауэра, амилолитическую способность микробов - на крахмальном агаре. Протеолитические свойства микробов определяют на средах, не содержащих глюкозу и глицерин, - мясо-пептонном желатине, свернувшейся лошадиной сыворотке, молочном агаре. Мясо-пептонный желатин засевают путём укола до дна пробирки, инкубируют при t 20-22{{°}}C, а затем определяют степень разжижения желатина. Гемолитическую способность микробов устанавливают путём высева на кровяной агар или бульон с кровью. Для определения редуцирующей активности микробов применяют Д.-д. с. с красителями (метиленовый синий, лакмус, индидокармин, тионин и др.). По мере роста микробов происходит полное или частичное обесцвечивание или изменение цвета красителя. Используют также среды с нитратами, в которых под воздействием ферментов определенных микробов нитраты восстанавливаются в нитриты и далее - в аммиак или свободный азот.

Существуют специальные селективные среды для выращивания анаэробов (Китта-Тароцци среда и др.), идентификации некоторых бактерий кишечной группы, сальмонелл (среды Эндо, Левина, Симмонса, Плоскирева и др.), для определения подвижности микробов, их отношения к кислороду (среда Пешкова) и др. Возбудителя туберкулёза выращивают на специальных яичных средах Петраньяни, Ливенштейна-Йенсена, Гельберга, возбудителей паратуберкулёза - на среде Дюбо-Смита, бруцеллёза - на средах Альбини, Вейбриджа, Корнеевой; возбудителя вибриоза - на среде ГНКИ. Микоплазмы наиболее успешно выделяются и поддерживаются на среде Эдварда и др. специальных средах; лептоспиры - на сывороточных средах Терских, Уленхута, Любашенко, альбуминовой среде ГНКИ. Возбудитель копытной гнили овец растет на мозговых средах с добавлением экстракта копытного рога и серусодержащих аминокислот; грибы - на средах Саоуро, Чапека и др.